HIV核心抗原p24检测方法的建立及应用

ＨＩＶ感染的检测在预防ＡＩＤＳ传播方面有重要作用。本研究以重组抗原ｐＧ１免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术建立了５株识别ＨＩＶ核心抗原ｐ２４的杂交瘤细胞株Ｄ３，１Ｈ１，２Ｇ１０，３Ｈ５和４Ｈ６。经鉴定这５株ＭｃＡｂ与其它病毒抗原无交叉反应，分别识别３个不同的抗原表位。应用两株识别不同表位的ＭｃＡｂ２Ｇ１０和３Ｈ５建立了检测ＨＩＶｐ２４抗原的夹心ＥＬＩＳＡ法，并初步检测了２４份ＨＩＶ抗体阳性血清。     

阻断CD40/CD40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间

目的：克隆表达人CD40-Ig融合蛋白，并在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中研究利用其阻断CD40/CD40L相互作用的保护性效果。方法：利用RT-PCR技术自人Daudi细胞系中克隆CD40基因胞外区，并插入含有人IgG1Fc段基因的pIG1载体中，构建携带CD40-Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS-7细胞，间接夹心ELISA法检测CD40-Ig融合蛋白的表达，再将CD4-Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞，筛选分泌CD40-Ig融合蛋白的阳性重组CHO细胞并进行无血清大规模培养，收获培养上清利用ProteinA亲和层析法纯化融合蛋白。SDS-PAGE，Western blot和配基结合实验鉴定CD40-Ig的性质，将C57BL6/J（H-2^b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H-2^d)小鼠体内建立急性GVHD模型。通过体内注射CD40-Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果。结果：按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/40Ig和p3.1/40Ig。ELISA和Western blot确定在COS-7和CHO细胞中表达了CO40-Ig融合蛋白，SDS-PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在，纯化的CD40-Ig可与CD40L结合，体内应用CD40-Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间。结论：CD40/CD40L相互作用在GVHD的病理过程中可能扮演了十分重要的角色，提示人CD40-Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用潜力。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

人CD40—Ig融合蛋白表达载体的构建及其在COS—7细胞的表达

ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ途径是除Ｂ７／ＣＤ２８途径之外的重要的共刺激信号转导途径,在Ｔ细胞活化过程中扮演着十分关键的角色。因而,该途径可能在同种移植排斥的诱导和效应阶段的不同时期发挥关键作用。本研究旨在获得人ＣＤ４０分子胞外区和人ＩｇＧ１Ｆｃ段的融合蛋白,以探索阻断ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激途径在免疫治疗中的潜在应用。首先,从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｄａｕｄｉ中提取细胞胞总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人Ｃ     

B16细胞中FLT3表达的检测及FLT3-Ligand对B16细胞生长的抑制作用

目的：检测造血生长因子受体ＦＬＴ３ 在非造血来源的黑素瘤细胞系Ｂ１６ 中的表达,并研究其配基ＦＬＴ３－Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）对Ｂ１６ 细胞的作用。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｂ１６ 细胞中ＦＬＴ３ ｍ ＲＮＡ的表达,流式细胞仪检测ＦＬＴ３ 蛋白在Ｂ１６ 细胞表面的表达,在培养液中加入不同浓度的ＦＬ对Ｂ１６ 细胞进行培养。结果：ＦＬＴ３ 在Ｂ１６ 细胞中有ｍ ＲＮＡ 的表达,在Ｂ１６ 细胞表面有蛋白质的表达。ＦＬ对Ｂ１６ 细胞的生长有抑制作用,并且这种抑制作用是浓度依赖性的,在一定的浓度范围内随着ＦＬ浓度的增高而增强。结论：ＦＬＴ３ 的分布不仅仅局限于小鼠的造血系统和神经系统,也表达于上皮性的肿瘤细胞Ｂ１６ 中,并在其配基ＦＬ的作用下抑制Ｂ１６ 细胞的生长。     

复制型DNA疫苗的研究进展

复制型DNA疫苗是基于常规DNA疫苗和RNA复制子疫苗的基础上发展起来的一种新型疫苗，既具有稳定性好、安全性高的优点，又实现了外源基因的高效表达。本文就复制型DNA疫苗的构建、作用机制、优点以及最新的研究进展作一简要综述。     

DNA免疫法制备抗人Flt3-ligand单克隆抗体及其鉴定

Ｆｌｔ3 ｌｉｇａｎｄ(ＦＬ)是近几年新发现的一种相对分子质量 (Ｍｒ)为 30 0 0 0的糖蛋白 ,其中有Ｍｒ 为 120 0 0的糖类〔1,2〕,主要参与体内的造血调控。在体外培养体系中 ,Ｆｌｔ3 ｌｉｇａｎｄ可与ＩＬ 3,ＩＬ 6,ＳＣＦ及ＧＭ ＣＳＦ等细胞因子协同 ,刺激造血干 /祖细胞增殖 ,并能协同诱导造血干 /祖细胞分化为树突状细胞等 ,因而在造血干 /祖细胞的体外培养中获得广泛应用〔1,3〕。ＤＮＡ免疫法是一种新的制备单克隆抗体(ｍＡｂ)的免疫方法 ,它不需要制备大量抗原 ,只需将编码抗原的ｃＤＮＡ克隆到真核表达载体上 ,用重组质粒对动物…     

金标渗透法快速检测血清中丙型肝炎病毒抗体

采用基因工程技术克隆表达了丙型肝炎病毒（HCV）－Core-Ns3-Ns4优势表位嵌合抗原，研制出金标渗透法快速检测丙型肝炎病毒抗体试剂，与抗丙型肝炎病毒抗体酶联免疫检测试剂（HCV－ELISA）和重组免疫印迹分析检测试剂（HCV－RIBA3.0)进行了比较，其特异性、敏感性均达到了ELISA试剂水平。     

HIV核心抗原p24检测技术及其应用的研究进展

本文就国外ＨＩＶ主要核心抗原ｐ２４的体内免疫反应、检测方法及临床应用的研究进展作了归纳，评述了各种方法的主要优缺点和发展趋势，分析了ｐ２４抗原在ＡＩＤＳ研究中的重要地位和作用。     

分泌抗HIVp24单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步鉴定

以含人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）核心抗朱ｐ２４全部氨基酸序列的重组蛋白ｐＧ１免疫小鼠，用免疫脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，成功地建立了５株分泌抗ＨＩＶｐ２４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。经鉴定，这５株ＭｃＡｂ与乙肝核心抗原（ＨＢｃＡｇ），丙肝Ｃ区，ＮＳ－３区抗原不发生交叉反应，而与重组ｐ２４抗原产生特异反应，本组单抗的研制成功为建立检测ＨＩＶｐ２４抗原的方法奠定了基础。