qPCR快速检测金黄色葡萄球菌及MRSA方法的建立及评价

目的建立q PCR法快速检测金黄色葡萄球菌及其mec A基因,以期快速精准诊断金黄色葡萄球菌感染及初步判断耐药情况。方法从NCBI数据库下载金黄色葡萄球菌nuc、atl、ica B、fnb A、hla、srap基因序列用于鉴定标志筛选,mec A基因序列用于MRSA标志筛选;经DNA MAN比对后,选择各基因保守区分别设计1~2套引物、探针,建立单重及双重q PCR,用临床分离株及标准菌株筛选出检测性能最好的基因片段作为检测标志物,建立金黄色葡萄球菌鉴定和耐药双重q PCR检测方法,并进行性能评价。结果经筛选,金黄色葡萄球菌atl基因(CP009361.1:1010217~1010341)、mec A基因(KF058908.1:1715~1843)两片段检测性能最优,将其作为标志物建立双重q PCR法。该方法的检测下限均低至4 copies/反应;扩增线性范围均达2.0×102~8copies/m L。335份金黄色葡萄球菌(含94份MRSA)培养阳性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 335份,MRSA 94份;95份金黄色葡萄球菌培养阴性的患者样本中,q PCR法分别检出SA 17份,MRSA 4份,经PCR产物测序,与标准菌株同源性均≥90%。双重q PCR法从样品处理到报告结果≤2.0 h。结论 q PCR法方法简便、快速、灵敏度高、特异性好,可望提高金黄色葡萄球菌感染的诊断能力并实现快速检测,为尽早精准治疗赢得时间。     

130例表皮葡萄球菌临床分离株的耐药性分析和mecA/icaA/icaD基因研究

目的 了解蚌埠医学院第一附属医院2013年检出130株表皮葡萄球菌的临床分布特征,研究其耐药性和mecA/icaA/icaD基因的携带等情况,为临床合理使用抗生素提供实验依据.方法 130株表皮葡萄球菌采用法国梅里埃VITEK2-compact全自动细菌鉴定药敏分析仪和配套的药物敏感复合板,血培养系统采用美国BD公司的全自动血培养仪进行菌种鉴定和药物敏感试验.研究数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析;用PCR方法检测mecA/icaA/icaD基因.结果 本年度,共检出130株表皮葡萄球菌,主要来自于外科32株(24.61％),ICU科23株(17.69％),儿科18株(13.85％)和感染科16株(12.31％);以血液,脑脊液,骨髓来源为主(113株,86.92％).检出耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(MRSE 110株,84.62％),明显高于甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌(MSSE),其差异有统计学显著性(P＜0.05).对MRSE敏感率较高的抗生素主要为:利奈唑胺(100％),万古霉素(100％),呋喃妥因(98.18％),利福平(77.27％),莫西沙星(72.73％)和庆大霉素(70.00％)等.mecA/icaA/icaD基因在血培养来源(20株),分别与非血培养来源(10株)和环境皮肤来源(9株)表皮葡萄球菌的检出率,结果比较无显著性差异.结论 我院分离的表皮葡萄球菌,以MRSE为主,未发现耐万古霉素表皮葡萄球菌,表皮葡萄球菌mecA阳性率极高,icaA和icaD基因阳性率较低.     

Novel strategies for rapid identification and susceptibility testing of MRSA

ABSTRACT

Introduction

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is associated with adverse clinical outcomes and increased morbidity, mortality, length of hospital stay, and health-care costs. Rapid diagnosis of MRSA infections has been associated with positive impact on clinical outcomes.     

一种PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株新方法的建立

目的建立一种PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株新方法。方法收集2016年1月至2018年12月入住本院ICU的重症患者的脓液、分泌物、血液等标本中分离培养病原菌株,共43个样本,且均为初次分离所得。以mecA基因检测呈阳性为"金标准",对样本分别进行实时荧光PCR检测和纸片扩散法检测。结果实时荧光PCR方法检测法准确度高于头孢西丁及苯唑西林纸片扩散法;所有耐甲氧西林葡萄球菌对青霉素和苯唑西林药耐药性最强,对红霉素和克林霉素次之,对万古霉素、利奈唑胺、替加环素、利福平均表现为敏感,对四环素、庆大霉素等具备一定的敏感性。结论新建立的荧光PCR检测法相比头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林纸片扩散法不仅准确度高,而且特异性好,能够准确检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。     

聚合酶链反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因

建立聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ．ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）ｍｅｃＡ基因的技术。四种ＤＮＡ提取方法检测灵敏度依次为超声裂解法（５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）、溶菌酶表面活性剂法（５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ），表面活性剂法（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）和直接煮沸法（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ），直接煮沸法具有简便性。引物的正链位于１８１～２００、负链位于３１１～３３０，序列分别为５＇－ＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＴ，５＇－ＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧＴ，其扩增产物长度为１５０ｂｐ。五种常见菌证明本法具有较高特异性。苯唑青霉素ＭＩＣ水平与ｍｅｃＡ基因之间具有很好的相关性，ＭＩＣ≥４μｇ／ｍｌ的２２株菌均检出ｍｅｃＡ基因，提示苯唑青霉素常规检测ＭＲＳＡ的可行性。ＰＣＲ方法对于隐匿型耐药株的检出具有重要价值。     

多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌lukS/F-PV和mecA基因

目的建立一种新的多重PCR方法,检测临床分离金葡菌的杀白细胞素毒力基因(lukS/F-PV)和甲氧西林耐药基因(mecA)。方法收集我院2006年1—12月从临床多种标本中分离鉴定的不重复金葡菌,应用多重PCR技术,优化反应条件,同时扩增葡萄球菌属特异性基因16S rRNA、金葡菌种特异性基因nuc、lukS/F-PV基因和mecA基因,扩增产物经凝胶成像系统分析。结果217株金葡菌经多重PCR检测,31株是16S rRNA+nuc+lukS/F-PV+mecA基因型,3株是16SrRNA+nuc+lukS/F-PV基因型,135株是16S rRNA+nuc+mecA基因型,40株是16S rRNA+nuc基因型,其中5株仅扩增出16S rRNA基因,3株仅扩增出nuc基因。lukS/F-PV基因和mecA基因测序显示与GenBank中的已有序列具有高度同源性,其阳性率分别为15.7%(34/217)和76.5%(166/217);34株lukS/F-PV基因阳性的分离株中,31株为MRSA,占91.2%(31/34)。结论本方法适用于快速检测和鉴定产杀白细胞素MRSA,lukS/F-PV基因阳性的菌株以MR...     

医院感染金黄色葡萄球菌的耐药性和SCCmec基因型分析

目的 了解天津市肿瘤医院医院感染金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药状况和葡萄球菌盒式染色体mec（SCCmec）基因型特点。方法检测89株医院感染金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感性及其mecA携带率,用多重PCR法对mecA阳性菌株进行SCCmec基因分型。结果89株金黄色葡萄球菌中表型甲氧西林耐药率为23．6％（21／89）,mecA基因检出率为43．8％（39／89）,两者比较差异有统计学意义（X^2=8．146．P=0．004）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出多药耐药特点,未发现万古霉素耐药株。SCCmec基因型以Ⅲ型最为常见,占66．7％（26／39）。结论天津市肿瘤医院分离的MRSA具有多重耐药特点,SCCmec基因型以Ⅲ型为主。     

MRSA Harboring mecA Variant Gene mecC, France

We describe human cases and clustered animal cases of mecA(LGA251)-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus in France. Our report confirms that this new variant has a large distribution in Europe. It may represent a public health threat because phenotypic and genotypic tests seem unable to detect this new resistance mechanism.     

非PBP2a型苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌的研究

目的：探讨从临床分离的表型为苯唑西林(OXA)耐药(OR)的金黄色葡萄球菌(金葡菌)是否存在mecA基因以外的耐药机制。方法：表型为OXA耐药(OR)的金葡菌130株，其中五种非β—内酰胺类药物(庆大霉素、环丙沙星、林可霉素、四环素、红霉素)三种以上耐药(OR—R)125株，三种以上敏感(OR—S)5株；表型为OXA敏感(OS)的金葡菌，五种非β—内酰胺类药物3种以上耐药(OS—R)14株。采用OXA，OXA／克拉维酸(CA)双纸片扩散试验，青霉素和苯唑西林酶浸出三维试验和mecA基因聚合酶链反应(PCR)三种试验，分别检测青霉素酶、苯唑西林酶和mecA基因。结果：130株OR和14株OS双纸片试验均为阴性，三维试验中青霉素酶均阳性，苯唑西林酶均阴性。125株OR—R型菌均检出mecA基因；5株OR—S菌中有3株未检出mecA基因，2株检出mecA基因；14株OS—R菌均未检出mecA基因。结论：表型为OXA耐药而非β—内酰胺类药物以敏感为主的金葡菌中，存在mecA基因和苯唑西林酶均为阴性的耐药型菌株，占OXA耐药株中的2．3％(3／130)。其耐药机制可能与青霉素结合蛋白(PBPs)的改变导致了OXA的亲和力下降有关。     

成都地区儿童金黄色葡萄球菌定植/感染分离株的流行病学研究

目的调查成都地区儿童金黄色葡萄球菌定植/感染分离株的流行病学特征。方法 2004年1月—2009年4月,以成都市健康儿童、门诊呼吸道感染患儿和金黄色葡萄球菌感染住院患儿为研究对象,采集鼻拭子或感染部位标本进行培养,并对分离的金黄色葡萄球菌进行药敏实验,应用PCR方法检测菌株的PVL毒力基因和mecA耐药基因,对菌株进行多位点序列分析(MLST)。结果培养分离金黄色葡萄球菌定植株174株、感染株51株。门诊呼吸道感染患儿金葡菌的多重耐药率分别为,定植株59.3%,感染株52.9%;PVL基因阳性率分别为,定植株55.6%(15/27),感染株80.4%(41/51);mecA耐药基因阳性率分别为,定植株11.1%(3/27),感染株62.7%(32/51)。对健康儿童定植株以及感染株进行MLST分析,共发现33个ST类型,定植株以ST121、ST59和ST398为主,感染株以ST121、ST88和ST398为主;这些菌株属于15个克隆类型,以CC121、CC59和CC398为主。结论成都地区儿童金黄色葡萄球菌定植和感染分离株具有较高的PVL毒力基因和mecA耐药基因携带率,具有明显不同于其他地区的独特的遗传背景。