己烯雌酚对Wistar大鼠乳腺癌发生的干预作用

背景与目的:作为一类人工合成雌激素药物,二乙基己烯雌酚(diethyl-stilbestrol,DES)被广泛应用于治疗雌激素不足所致的更年期综合征及骨质疏松症等,但其对乳腺上皮细胞作用的研究有待进一步探讨。本研究通过建立与人相似的Wistar大鼠乳腺癌发生的模型,并用DES进行干预,观察DES在Wistar大鼠乳腺癌发生过程中的作用。方法:利用不同剂量的DES干预二甲基苯蒽[7,12-dimethylben(a)anthracene,DMBA]诱导Wistar大鼠乳腺癌模型,研究其对乳腺上皮细胞的作用。实验分为6个组:对照组、DES1组、DMBA组、DES1+DMBA组、DES2+DMBA组和DES3+DMBA组,其中DES1、DES2和DES3中DES剂量分别为:0.1mg·kg-1·d-1、0.2mg·kg-1·d-1和0.4mg·kg-1·d-1喂养大鼠,观察44周处死大鼠,取乳腺组织作常规病理分析以及核仁组成区相关嗜银蛋白(silver-binding nucleolar organizer regions,AgNOR)计数、PCNA染色强度指数(proliferating cell nuclear antigen staining intensity index,PCNA SII)、Bcl-2和C-erbB-2蛋白表达测定。结果:DMBA组和DES1+DMBA组分别有13只和2只Wistar大鼠发生癌变;单纯DES1组大鼠乳腺上皮细胞AgNOR计数及PCNASII水平上升,Bcl-2及C-erbB-2的表达提高,但未导致癌变;与其他组相比,DES2+DMBA组大鼠乳腺上皮细胞的AgNOR计数和PCNASII水平下降,Bcl-2及C-erbB-2的表达降低(P<0.05);DES3+DMBA组上述指标与DES1+DMBA组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:单纯小剂量DES可导致大鼠乳腺上皮细胞增生,但不导致乳腺组织癌变;在DMBA诱发大鼠乳腺上皮细胞癌变过程中,小剂量DES可以促使乳腺导管上皮细胞增生、乃至癌变;而中等剂量DES可以明显抑制大鼠乳腺上皮细胞增生,加大DES剂量,抑制作用不增强。     

食管鳞状细胞癌中CDH1基因启动子区甲基化状态与β-catenin异质表达的相关性

目的:研究食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Cancer,ESCC)中CDH1(cadherin 1)基因的甲基化状态,探讨其与Wnt中心因子β-catenin表达及与食管鳞癌发生的关系.方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)及RT-PCR的方法检测91例食管鳞癌中CDH1基因的甲基化状态及其mRNA表达情况,应用免疫组织化学的方法检测β-catenin蛋白的表达情况,并分析与临床病理参数间的关系.结果:在91例食管鳞癌中,有72例CDH1基因发生了甲基化,甲基化率为79.1%,明显高于癌旁非肿瘤组织(P＜0.01);癌组织中CDH1基因的高甲基化与肿瘤患者的临床分期相关,与病理分级无关;癌组织中该基因mRNA的阳性表达率42.9%,明显低于癌旁非肿瘤组织(97.8%,P＜0.01);癌及癌旁组织中β-catenin蛋白的异质表达率分别为89.0%和24.2%,差异均有统计学意义(P＜0.01):癌组织中CDH1基因mRNA表达及β-catenin蛋白的异质表达均与该基因的甲基化状态明显相关(P＜0.05).结论:CDH1基因启动子区甲基化在食管鳞癌中频繁发生,该基因的高甲基化状态可能是引起食管鳞癌发生的分子机制之一,并有可能通过Wnt/β-catenin信号传导通路发挥作用.     

长链非编码RNA XLOC_002319在食管鳞癌中表达及其甲基化状态

目的:通过检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中长链非编码RNA XLOC_002319(long non-colding RNA XLOC_002319,lncRNA XLOC_002319)基因的表达及其甲基化状态,探讨XLOC_002319基因在ESCC发生及发展中的作用.方法:分别应用RT-PCR以及甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)的方法检测DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine,5-aza-dC)处理前后的食管癌细胞株(TE1、TE13、Yes-2、Eca109和T.TN)、ESCC组织以及癌旁正常组织、食管上皮内瘤变(esophageal intraepithelial neoplasia,EIN)组织中XLOC_002319基因的表达和甲基化状态.结果:未经5-aza-dC处理的5种食管癌细胞中XLOC_002319基因的表达均呈阴性或弱阳性,经5-azadC的5种食管癌细胞中XLOC_002319基因的表达均增高.5株食管癌细胞在5-aza-dC处理前表现为XLOC_002319高甲基化状态,处理后,Eca109和T.TN细胞系中XLOC_002319基因甲基化程度降低,其余3株细胞系中XLOC_002319基因均表现为非甲基化状态.XLOC_002319基因在ESCC组织中的表达显著低于食管上皮内瘤变组织和癌旁正常组织(P＜0.01),并与组织学分化程度和TNM分期密切相关(P＜0.05).ESCC组织中XLOC_002319基因启动子区甲基化率为63.75％ (51/80),显著高于食管上皮内瘤变组织和癌旁正常组织(P＜0.01),并与淋巴结转移、组织学分化程度和TNM分期密切相关(P＜0.05).发生XLOC_002319基因甲基化的ESCC组织中XLOC_002319基因表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织(P＜0.01).结论:XLOC_002319基因在ESCC中的低表达可能与ESCC的发生密切相关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一.     

贲门腺癌组织中Smad基因家族不同成员的表达及其临床意义

目的:检测贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中Smad基因家族不同成员的表达水平及其相关性,并探讨其临床意义。方法:收集河北医科大学第四医院2004至2009年间病理确证的贲门腺癌患者110例,RT-PCR检测贲门腺癌和癌旁组织中Smad2、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA的表达,免疫组织化学方法检测贲门腺癌组织和癌旁组织中p-Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白的表达并分析其相关性,分析p-Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白表达与贲门腺癌临床病理特征的关系。结果:贲门腺癌组织中Smad2、Smad3和Smad4 mRNA表达水平均显著低于相应癌旁组织[(0.4956±0.1862)vs(0.8611±0.2914),P<0.01;(0.4713±0.1712)vs(0.8314±0.2811),P<0.01;(0.5145±0.1987)vs(0.8954±0.2856),P<0.01],而Smad7 mRNA表达水平显著高于癌旁组织[(0.5114±0.1962)vs(0.2012±0.1006),P<0.01]。贲门腺癌组织p-Smad2/3、Smad4蛋白表达的阳性率显著低于癌旁组织(42.7%vs 93.6%,P<0.01;45.5%vs 95.5%,P<0.01),且与肿瘤TNM分期和组织分化程度密切相关(P<0.05)。贲门腺癌组织Smad7蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织(48.2%vs 3.6%,P<0.01),且与肿瘤组织分化程度密切相关(P<0.05)。贲门腺癌中p-Smad2/3与Smad4蛋白的表达呈正相关,但它们均与Smad7蛋白表达无明显的相关性。结论:贲门腺癌组织低表达Smad2、Smad3和Smad4,高表达Smad7,Smad基因的异常表达可能参与贲门腺癌的发生、发展。     

食管鳞癌及贲门腺癌中分泌型卷曲相关蛋白4基因启动子区甲基化状态的联合检测

目的:检测食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)和贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中分泌型卷曲相关蛋白4(secreted frizzled related protein 4, SFRP4)的基因甲基化状态,探讨其与食管鳞癌和贲门腺癌发生的关系.方法:应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)及RT-PCR的方法检测49例食管鳞癌及58例贲门腺癌中SFRP4基因的甲基化状态及其mRNA表达情况,应用免疫组织化学法检测Wnt通路中心因子β-catenin蛋白的表达情况,并分析其与临床病理参数间的关系.结果: 在食管鳞癌及贲门腺癌中,SFRP4基因的甲基化率分别为42.6%(21/49)和72.4%(42/58),均明显高于癌旁非肿瘤组织(P<0.01).在贲门腺癌中SFRP4基因的高甲基化与肿瘤患者的临床分期相关,与病理分级无关;而在食管鳞癌中,该基因的甲基化与各临床病理指标均无关(P>0.05).SFRP4基因在食管鳞癌及贲门腺癌中mRNA阳性表达率分别为69.3%(34/49)和44.8%(26/58),均明显低于癌旁非肿瘤组织(P<0.05),且肿瘤组织中mRNA表达与该基因的甲基化状态明显相关(P<0.01).通路中心因子β-catenin蛋白在食管鳞癌及贲门腺癌中的异质表达率分别为65.3%(32/49)和86.2%(50/58),均明显高于癌旁非肿瘤组织(P<0.01),且其异质表达与SFRP4基因的甲基化状态相关(P<0.05).结论:SFRP4基因的高甲基化状态可能是引起贲门癌及食管癌发生的共同分子机制之一,并有可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路发挥作用. 检测SFRP4基因甲基化状态对于贲门腺癌的预后评估有一定参考价值.     

NDRG2基因在贲门腺癌中的甲基化状态及表达

目的： 探讨贲门腺癌(GCA)中NDRG2(N-myc downstream-regulated gene 2)基因启动子区的甲基化状态,并分析其甲基化与表达之间的相关性。方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测97例贲门腺癌组织及相应癌旁组织中NDRG2基因的甲基化状态,应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测97例贲门腺癌组织及相应癌旁组织中NDRG2的mRNA和蛋白表达情况。结果：NDRG2基因启动子区在贲门腺癌组织中的甲基化率(49.5%)显著高于癌旁正常组织(5.1%)(P<0.05),且Ⅲ期和Ⅳ期贲门腺癌患者中NDRG2基因甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,低分化组中NDRG2基因发生甲基化的比率显著高于高中分化组。贲门腺癌组织中NDRG2 mRNA表达水平显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。贲门腺癌组织中NDRG2蛋白表达阳性率为44.3%(43/97),显著低于相应癌旁正常组织的蛋白表达94.8%(92/97)(P<0.01),且贲门腺癌组织中NDRG2蛋白表达缺失与其启动子区的甲基化有明显的相关性(r=-0.510,P<0.01)。结论：NDRG2基因启动子区的高甲基化导致的基因沉默可能是贲门腺癌中此基因表达降低的机制之一。     

Atrogin-1基因在贲门腺癌组织中的表达及其异常甲基化

目的：探讨atrogin-1基因在贲门腺癌（gastric cardia adenocarcinoma,GCA）中的异常甲基化及表达,并分析其临床意义。方法: 选用河北医科大学第四医院2004—2008年间的贲门腺癌患者手术标本共139例,分别应用亚硫酸氢盐转换-甲基化特异性PCR（bisulfite conversion-methylation specific polymerase chain reaction,BS-MSP）、RT-PCR和免疫组织化学法检测贲门腺癌组织及相应癌旁（距癌灶边缘3～5 cm）组织中atrogin-1基因的甲基化、mRNA和蛋白表达情况,应用免疫组织化学法检测相应组织中Smad4蛋白的表达。结果: 贲门腺癌组织中atrogin-1基因启动子区的甲基化率\[44.6%（62/139）\] 显著高于癌旁组织\[3.6%(5/139)\]（χ2=63.891,P=0.001）,且atrogin-1基因的甲基化与TNM分期及肿瘤的组织学分化程度密切相关（χ2=6.144, P<0.05）。贲门腺癌组织中atrogin-1基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于癌旁组织\[(0.482 5±0.175 4) vs (0.896 9±0.290 1),t=10.62, P=0.01;34.5% vs 82.0%, χ2=4.441,P=0.001\],且与其启动子区的甲基化状态之间有明显的相关性(r=-0.256,P=0.001)。贲门腺癌组织中Smad4蛋白表达的阳性率显著低于癌旁组织（46.0% vs 95.7%; χ2=2.945,P=0.001）,且与atrogin-1蛋白表达之间呈明显的正相关(r=0.604,P=0.001）。结论: Atrogin-1基因启动子区高甲基化导致的基因沉默可能是贲门癌组织中此基因表达降低的机制之一。     

RASSF7在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

目的：检测食管鳞癌 (esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中Ras相关区域家族7（Ras-association domain family 7,RASSF7）的mRNA、蛋白表达情况及甲基化状态,探究RASSF7基因在ESCC发生发展中的作用。方法：分别应用RT - PCR 及甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction ,MSP)的方法检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine, 5-aza-dC）处理前后的4株食管癌细胞系（TE13、T.Tn、YES-2、Ec109）和69例ESCC组织及其癌旁组织中RASSF7 mRNA表达水平及甲基化状态,应用免疫组织化学方法检测69例ESCC组织及相应癌旁组织中RASSF7的蛋白表达。结果：RASSF7基因在TE13、T.Tn、YES-2细胞系中表达阳性,在Ec109食管癌细胞系中表达缺失,经5-aza-dC处理后,RASSF7在TE13、T.Tn、YES-2中表达下调,在Ec109中表达阳性。5-aza-dC处理前后4株食管癌细胞系中均未检测到RASSF7的甲基化。ESCC组织中RASSF7的mRNA相对表达量（0.63?0.08 vs 0.42?0.20,P<0.01）与蛋白表达阳性率[56（81.2%） vs 37（53.6%）,P<0.01]均显著高于相应癌旁组织,且均与患者的淋巴结转移情况及分化程度有关（P<0.05或P<0.01）,与TNM分期、年龄和性别无关（均P＞0.05）。ESCC组织和相应癌旁组织中均未检测到RASSF7的甲基化。结论：4株食管癌细胞系、肿瘤组织和癌旁组织中RASSF7基因的表达差异与RASSF7本身甲基化状态无关,ESCC组织中RASSF7的高表达可能参与了ESCC的发生及转移。     

大鼠中槐茶90天喂养和致畸试验

中槐茶是以槐实为主要原料加工制成的浸泡饮料。在完成急性毒性、蓄积毒性和致突变试验的基础上用Wistar大鼠进行了90天喂养和致畸试验。 将中槐茶成品茶样6克,加沸水至100毫升浸泡30分钟,过滤制得茶汤。按国家《食品安全性毒理学评价程序》的要求进行90天喂养试验,三个试验组的中槐茶浓度为1％、3％和6％,另设饮凉开水的对照组。     

胃癌中Wnt信号通路的激活及E-cadherin/catenins的异常表达

目的探讨胃癌中Wnt信号通路与E-cadherin/catenins复合体的关联性及其与胃癌浸润转移的关系,为指导临床治疗与判断预后提供有价值的分子指标。方法应用免疫组织化学SP法检测Wnt2、β-catenin、α-catenin、E-cadherin在胃癌中的表达及流式细胞术测定β-catenin在胃不同组织中的总含量。结果胃癌中β-catenin出现膜表达缺失,浆表达增强,总表达量下降;Wnt2呈强表达,而α-catenin、E-cadherin出现膜表达缺失。β-catenin的异位表达与淋巴结转移及肿瘤浸润深度有关,Wnt2的表达仅与肿瘤的浸润深度有关,α-catenin的异常表达仅与病理分级有关,E-cadherin的异常表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、病理分级、临床分期有关。结论胃癌中Wnt信号通路处于激活状态,E-cadherin/catenins复合体表达也明显异常,并通过影响β-catenin的细胞内分布,与Wnt传导通路产生交互协同作用,共同影响胃癌的发生、侵袭、转移进程。