超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较

目的 对超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞上清外泌体优缺点进行比较,为外泌体相关基础实验研究及临床检测提供方法学参考。方法 收集前列腺癌细胞上清分别用两种方法提取外泌体,进行电镜鉴定、BCA定量测定蛋白浓度、Western blot检测标志蛋白以及Zetaview颗粒粒径、浓度及电势分析,比较两种方法提取外泌体的优缺点。结果 电镜下两种方法均可观察到具有膜结构的典型的类似于茶托状结构的外泌体,但膜亲和柱法提取外泌体背景中有类似蛋白聚合物等杂质的存在,超离背景纯净,每个视野下的外泌体数量要明显多于QIAGEN膜亲和柱法; Western blot测定标志蛋白,根据BCA定量同等上样量超速离心法可观察到明显的β-actin,ALIX,CD63以及EGFR条带,而QIAGEN膜亲和柱法仅可观察到β-actin,ALIX以及EGFR条带,但均较超速离心法条带弱; Zetaview粒径分析,超速离心法粒径分布峰值为116 nm,膜亲和柱法提取外泌体分布峰值为122 nm,均符合外泌体的粒径分布范围; 电势分析两者均为负值,符合外泌体的电势分布; 而颗粒数与蛋白浓度比值超速离心法提取外泌体要高于QIAGEN膜亲和柱法(t=13.47,P<0.01)。结论 超速离心法与膜亲和柱法均可以从细胞上清中提取外泌体,超速离心法步骤繁琐,时间较长,但外泌体纯度高,杂质少,BCA蛋白定量与实际所含外泌体蛋白量基本一致; QIAGEN膜亲和柱法方法简单,可快速从细胞上清中提取到外泌体,但纯度不及超速离心法,BCA蛋白定量比实际所含外泌体蛋白量要高,超速离心法适用于外泌体的各方面研究,而QIAGEN膜亲和柱法由于有杂蛋白的污染,因此更适用于外泌体核酸分析相关研究。     

细胞外囊泡在肿瘤诊断中的应用

细胞外囊泡（EV）具有分布广泛,内容丰富,全面参与调控重要的细胞生理活动等特点。作为肿瘤诊断的新技术,EV的天然优势包括保护其内容物,易于从各种体液中获取,有望真正无创以及高度组织源性等。为了适用于临床检测,诸多EV分离技术如微流控、免疫芯片、纳米流式、声学捕获等技术不断被开发。目前已有EV肿瘤诊断产品已走向临床,但是...     

细胞外囊泡DNA在肿瘤诊断中具有重要应用前景

细胞外囊泡（EV）作为一种新型的细胞间信号传导载体,几乎参与了肿瘤发生、发展、转移、耐药等各个环节。因此,EV已成为癌症诊断和抗癌治疗生物标志物的理想候选者和研究热点。但EV肿瘤标志物研究前期主要集中于RNA和蛋白质,少部分关注脂质,其DNA成分的相关研究较少。近年来EV DNA的肿瘤诊断价值才逐渐受到关注。对EV D...     

区域医学检验中心在提升基层医疗机构临床微生物检测水平中的作用

临床微生物学是诊治感染性疾病的关键学科,由于学科复杂性和医院感染控制专业技术人员缺乏,一直是基层医疗机构的短板。近年来,医疗卫生行政管理部门不断推动区域医学检验中心的建设,以此来推动分级诊疗,促进基层医疗机构检验水平的提高,提高检验同质化水平。区域医学检验中心可以集中优势资源建设强大的临床微生物检测中心,以支撑基层医疗机构的院内感染控制工作。文章对区域医学检验中心在提升基层医疗机构临床微生物检测水平的作用进行概述。     

前列腺癌LNCaP-AI+F细胞外泌体促进基质细胞WPMY-1 功能活化

[摘要] 目的：探讨前列腺癌外泌体对基质细胞WPMY-1 迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法：超速离心法提取前列腺癌LNCaP-AI+F细胞上清中的外泌体,电镜观察外泌体的典型形态结构,Zetaview 检测外泌体的粒径分布,Wb鉴定外泌体标志蛋白及其他相关蛋白。将WPMY-1 细胞与前列腺癌外泌体（40 μg/ml）共孵育后,激光共聚焦显微镜观察WPMY-1 细胞对PKH67 标记的外泌体的摄取情况,Transwell 实验检测WPMY-1 细胞迁移和侵袭能力,qPCR检测IL-8、PDGFB和MMP9 等三种肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)分子表达水平,Wb检测EGFR和ERK1/2 蛋白磷酸化水平。结果：电镜下可观察到典型茶托状外泌体结构,外泌体粒径分布集中在100 nm左右,其标志蛋白CD63 和ALIX的表达证实了所提取颗粒为外泌体。此外,外泌体还表达EGFR、HER2 和SRC 等三种与前列腺癌进展相关的蛋白。WPMY-1 细胞与外泌体共孵育后,共聚焦显微镜下可看到该细胞摄取大量外泌体,明显促进WPMY-1 细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.01）;与对照组比较,外泌体（40 μg/ml）处理后WPMY-1 IL-8、PDGFB及MMP9 表达水平增高（P<0.05 或P<0.01）;且外泌体促进了WPMY-1 细胞EGFR和ERK1/2 的磷酸化（P<0.01）。结论：前列腺癌细胞可通过外泌体作用于基质细胞WPMY-1,使其高表达多种CAF 相关分子,促进EGFR 和ERK1/2 的磷酸化,增强其迁移和侵袭能力。