周期型马来丝虫CPI基因克隆和序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的 克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因,并通过序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测,为进一步研究该基因的功能奠定基础.方法 从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增BmCPI基因,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-TBmCPI,经测序验证,并进行同源性比较.应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测.结果 RTPCR扩增出一条约621 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.其编码产物经表位预测分析,B细胞表位可能在23～32、50～79、117～126位氨基酸区域.结论 成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组质粒pGEM-T克隆载体,并进行了序列测定及编码产物的B细胞表位预测,达到预期目标,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

周期型马来丝虫副肌球蛋白基因克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的：克隆周期型马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因，进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测。方法：从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA，以mRNA为模板，RT-PCR法体外扩增BmPmy基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆人pGEM—T载体，转化E．coliDH5a，筛选阳性克隆，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒pGEM—TBmPmy，经测序验证，并进行同源性比较。应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测。结果：RT-PCR扩增出一条约2640bp的特异性条带，重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符，DNA序列分析与基因库已知的基因序列同源性为99％。经表位预测分析，BmPmy的B细胞表位可能在54～66位、144～152位、770～780位和834～845位氨基酸区域。结论：成功构建了BmPmy重组质粒pGEM—T克隆载体，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

SIL-2R及T细胞亚群在尖锐湿疣患者中的检测及临床意义

目的：探讨ＳＩＬ－２Ｒ及Ｔ细胞亚群在尖锐湿疣发病中的作用。方法：采用ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法及微量细胞毒试验法对７０例尖锐湿疣患者进行外周血可溶性白介素２受体（ＳＩＬ－２Ｒ）及Ｔ细胞亚群（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４／ＣＤ８）的检测,且与４０例健康人相比较。结果：尖锐湿疣患者ＳＩＬ－２Ｒ水平及ＣＤ８明显增高（Ｐ〈０．０５）,而ＣＤ４及ＣＤ４／ＣＤ８比率明显降低（Ｐ〈０．０５）,与临床皮损数目及是否     

周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析

目的在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70(HSP70)基因,并对表达产物进行SDS-PAGE分析。方法以重组质粒pGEM-T-HSP70为模板,根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物,用PCR法扩增HSP70基因(包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2 198 bp),PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中,构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导GST．Tag融合蛋白的表达,经SDS-PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEX-4T-3-HSP70全长约7 200 bp,经双酶切后应得到长度为4 968 bp的载体和2 198 bp的目的基因2个片段,1%琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量(Mr)为70×10~3,质粒pGEX-4T-3的融合部分(GST．Tag)表达产物的Mr约为26×10~3,将重组质粒转化BL-21 (DE3)菌,经IPTG诱导表达,菌体蛋白的SDS-PAGE图谱显示,诱导组出现特异性蛋白表达条带,其Mr约100×10~3,与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12%左右。结论成功地构建了重组原核表达载体pGEX-4T- 3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达,为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。     

华蟾素对慢性乙型肝炎患者外周血来源树突状细胞的影响

目的:研究华蟾素对慢性乙肝患者外周血来源的树突状细胞(dendritic cells,DCs)形态、表型和功能的影响,以了解华蟾素提高慢乙肝患者机体免疫力的作用机制。方法:实验研究分3组:正常对照组、慢乙肝组和慢乙肝华蟾素组。分离慢性乙肝患者和正常人外周血单核细胞(Monocytes,Mo),以GM-CSF和IL-4联合诱导培养生成DCs,慢乙肝华蟾素组于DCs培养48小时后加入华蟾素。各组DCs均于培养的第7天以相差显微镜观察和拍摄细胞形态;用流式细胞仪检测表面分子CD40、HLA-DR、CD80、CD86的表达水平;用CCK8法检测DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;用ELISA法检测DCs培养液上清中IL-12的水平。结果:与正常人相比,慢乙肝组患者外周血来源的DCs细胞形态相对不成熟,表面分子表达水平低,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌能力较弱;加入华蟾素培养的慢乙肝患者DCs与慢乙肝组比较,细胞形态相对成熟,表面分子CD40、CD80和CD86表达水平增高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌能力增强。结论:华蟾素能促进慢性乙肝患者外周血来源DCs的发育成熟,改善其功能。     

肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗瘤作用的影响

目的： 研究肿瘤抗原负载的树突状细胞（DCs）对原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)体外增殖和抗瘤作用的影响。 方法： 将自体肿瘤细胞匀浆粗提物(Tuly)与原发性肝癌患者外周血来源的DCs共培养以制备肿瘤抗原负载的DC(DCTuly)，将DCTuly与自体TILs在低浓度IL2(100 U/ml)中共培养，用FCM测定DCTuly 的表型以及与DCTuly混合培养前后的TILs表型，并计数TILs。用LDH法测定TILs的细胞毒作用。ELISA法检测TILs培养上清中IFNγ和TNFα的含量。 结果： DCTuly表面CD1a，CD83，CD80，CD86，CD40和HLA－DR分子表达水平增高（P<0.05）；DCTuly明显诱导TILs的增殖(P<0.01)及对自体肝癌细胞的细胞毒作用 (P<0.01), CD3+TILs增多（P<0.05）， CD4+TILs比例较混合前升高(P<001)，但仍以CD8+TILs为主。与DCTuly混合培养后第1,2天，TILs分泌IFNγ和TNFα的量明显提高(P<0.01)。 结论： 负载肿瘤抗原的DCs可促进TILs的增殖，增强TILs的特异性抗肿瘤活性。     

半巢式PCR一步法扩增伤寒患者单核细胞中伤寒沙门菌DNA

建立适用于临床检测血中伤寒沙门菌ＤＮＡ扩增方法。分离患者单核细胞，加热裂解制板ＤＮＡ，半巢式ＰＣＲ一步法扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。