C－myc反义寡聚脱氧核苷酸抑制人脑胶质瘤细胞系BT_（325）Myc蛋白合成和细胞增殖并诱导其分化的研究

目的：探讨在体外ｃ－ｍｙｃ反义核酸是否可通过阻断人脑胶质瘤细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达而抑制细胞增殖并诱导分化．方法：人工合成与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ起始码及其后四个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，用它处理培养的ＢＴ３２５细胞，观察它对细胞增殖的影响．同时用免疫细胞化学方法检测细胞中Ｍｙｃ蛋白的水平以及能反映胶质瘤细胞分化的Ｓ－１００和ＧＦＡＰ两种蛋白的水平，分析这些指标的变化．结果：发现４ｕｍｏｌ／Ｌ的ｃ－ｍｙｃ反义核酸明显抑制ＢＴ３２５细胞的增殖和Ｍｙｃ蛋白的合成，且后者发生在加入反义核酸后１ｈ，并持续２４ｈ以上，而细胞增殖受抑制要到第５日才明显．从第２日到第５日细胞中Ｓ－１００和ＧＦＡＰ染色明显加深，反映细胞有分化趋势．用同样长度的无关序列寡聚脱氧核苷酸作对照，则未见上述变化，表明ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用是序列特异性的．结论：ｃ－ｍｙｃ反义核酸可特异地抑制ＢＴ３２５细胞中Ｍｙｃ蛋白的合成和细胞增殖，并能诱导其分化．     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

神经营养因子3基因转染对庆大霉素性耳聋保护作用的实验研究

目的 :探讨阳离子脂质体介导的神经营养因子 3(NT3)基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋的保护作用。方法 :将携带外源性基因NT3的重组真核表达载体 pIRES2 EGFP NT3与阳离子脂质体复合物注入豚鼠耳蜗 ,术后给予庆大霉素肌肉注射 (12 0mg/kg) 14d ,分别于停药后 1d、2周进行听性脑干反应 (ABR)及畸变产物耳声发射 (DPOAE)测听并观察转染基因在耳蜗的表达和分布及耳蜗毛细胞受损情况。结果 :NT3组DP gram幅值降低较对照组明显减轻 ,ABR阈值升高亦无对照组显著 (P <0 .0 5 )。耳蜗基底膜FITC phalloidin染色见NT3组耳蜗毛细胞的缺失较对照组明显减轻。结论 :阳离子脂质体介导的NT3基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋具有一定程度的保护作用。     

诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立

目的 :构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体 ,并将其在Hela细胞中诱导表达 .方法 :用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列 ,克隆入pIND诱导表达载体中。将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后 ,用G4 18和zeocin筛选建系。通过免疫细胞化学染色法 ,确定蜕皮激素A最佳的诱导浓度及诱导时间 ,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察 ,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响。结果 :获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系。免疫细胞化学染色表明 ,30 μmol/L蜕皮激素诱导 5d时目的蛋白表达最强 ,同时观察到Hela细胞的形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 ,并且细胞生长受到抑制。骨架分析进一步显示 ,多核大细胞的骨架发生异常。结论 :活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立 ,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。同时发现由于bcl-2的ASON作用使HL-60细胞的     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

舌癌细胞系T-TFL的建立和生物学性状检测

背景：基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势，但舌癌基因治疗的研究报道极少。目的：构建含相关死亡结构域蛋白(FADD)及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因功能结构域的融合基因TFL，稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)中，检测建系细胞T-TFL的生物学性状，探讨一种更有利于舌癌患者治疗期及治疗后期内生活质量的治疗手段。设计：以诊断为依据，前瞻性研究。地点和对象：实验在第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科完成，研究对象为人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)，上海第二医科大学口腔医学院建系。干预：反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA，重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL，通过阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca-8113细胞中。主要观察指标：Westem blot检测融合蛋白TNFR1／DED表达，通过形态学观察、生长曲线等检测T-TFL细胞的生物学性状。结果：获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL，转染入Tca-8113细胞后，能表达融合蛋白TNFR1／DED活性，且T-TFL细胞与亲本Tca-8113细胞的生物学性状无明显差异。结论：T-TFL细胞能表达融合蛋白TNFR1／DED活性，可以为进一步深入研究舌癌基因治疗提供实验基础。     

Cloning and sequencing of the fourth exon of transforming growth factor α gene

Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｆｏｕｒｔｈｅｘｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒαｇｅｎｅ￥ＨｕｉＨｏｎｇｘｉａｎｇ（惠宏襄）；ＪｉｎＭｉｎｇ（金明）；ＨａｎＨｕａ（韩骅）；ＷａｎｇＣｈｅｎｇｊｉ（王成济）（...