人FascDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

为获得高质量及充足的Ｆａｓ蛋白，采用ＰＣＲ技术调整Ｆａｓ基因的开放阅读框架，使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致；缺失了ＦａｓｃＤＮＡ基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子，构建ＦａｓｃＤＮＡ和生物素化融合原核表达质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔ－Ｆａｓ。将重组质粒转入大肠杆菌ＨＢ１０１，经５００ｍｍｏｌＩＰＴＧ在３７℃条件下诱导４ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测融合蛋白在大肠杆菌得以高效表达，表达量为细菌总蛋白的１３．８％。用亲和层析树脂对生物素化融合蛋白进行亲和层析纯化，得到Ｆａｓ重组的蛋白，且表达的Ｆａｓ融合蛋白具有抗体结合活性。此蛋白的表达成功将解决Ｆａｓ膜蛋白不易提取的难题，为深入研究Ｆａｓ提供了良好材料来源     

流感病毒免疫防御机制研究进展

流感病毒感染引起免疫损伤的同时可以激发机体产生免疫应答,在病毒的清除与疾病的恢复及再次感染过程中发挥着有效的防御作用.尽管流感病毒经常发生变异,但自然感染诱导的免疫防御机制仍可提供一定程度的交叉保护作用.这一系列免疫应答的激发及形成包括多种分子及细胞的参与,其发生、发展及转归直接决定着疾病的严重程度及免疫预防的有效性.了解天然免疫应答、粘膜免疫应答及获得性免疫应答的激发与维持可为流感病毒的防治及疫苗的研制提供思路.     

流感病毒免疫防御机制研究进展

流感病毒感染引起免疫损伤的同时可以激发机体产生免疫应答,在病毒的清除与疾病的恢复及再次感染过程中发挥着有效的防御作用.尽管流感病毒经常发生变异,但自然感染诱导的免疫防御机制仍可提供一定程度的交叉保护作用.这一系列免疫应答的激发及形成包括多种分子及细胞的参与,其发生、发展及转归直接决定着疾病的严重程度及免疫预防的有效性.了解天然免疫应答、粘膜免疫应答及获得性免疫应答的激发与维持可为流感病毒的防治及疫苗的研制提供思路.     

Fas cDNA克隆、表达及重组蛋白纯化的研究

目的:获得高质量及充足的Fas重组蛋白。方法:采用PCR构建表达重组质粒,亲和层析纯化Fas重组蛋白,ELISA检测其免疫学功能。结果:①PCR扩增获得目的片段约 470 bp。②Sanger双脱氧链终止法测序表明,该 DNA序列仅 174位由A→G突变,属于同义突变,与已知的Fas膜外区氨基酸完全一致。③重组质粒经IPTG诱导有一蛋白得以表达,其目的融合蛋白占细菌总蛋白的17. 4%,分子量约为 34．3 kD。④经 Factor Xa切割 Fas融合蛋白,纯化获得 Fas重组蛋白,Western印迹出现特异性Fas蛋白带,分子量为21．3kD,与预测结果相吻合。⑤ELISA检测 Fas重组蛋白,具有抗体的免疫学活性。结论:成功地表达并纯化了Fas重组蛋白,解决了Fas不易获得的难题,为研究Fas提供了良好的实验材料。     

布鲁氏菌DNA疫苗的发展：过去、现在和未来

布鲁氏菌病(Brucellosis)是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一，其致病菌为胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，感染机体后主要激发细胞保护性免疫反应。新兴的DNA疫苗将表达的目的蛋白以肽的形式递呈给MHCI后能激活抗原特异性T细胞，诱发细胞介导的免疫反应，为控制布鲁氏菌病提供了一条可行途径。1997年第一种布鲁氏菌DNA疫苗pCDNA3-L7／L12构建成功并在动物实验中表现出了潜在的应用前景。本文介绍了现有的目前几种较为成功的布鲁氏菌DNA疫苗，分析其优、缺点，并探讨了未来提高其免疫效果的可能途径。     

DNA疫苗免疫原性的研究策略

DNA疫苗既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫，是近年来疫苗研究的热点领域，被称为疫苗史上的第三次革命。但DNA疫苗诱导特异性免疫应答的水平不高，限制了它的广泛应用。本对提高DNA疫苗免疫原性的几种策略进行综述。     

传染性非典型肺炎疫苗的研制:重组真核质粒PVAX1/SARS-CoVM的构建及免疫原性研究

目的:构建真核表达质粒PVAX1/M,免疫Balb/c小鼠,测定其诱导的特异性免疫应答,探讨传染性非典型肺炎(severeacuteresperatorysyn-drome,SARS)防治和康复的可能手段。方法:根据GenBank中登录的SARS-CoVM蛋白基因序列设计引物,采用反转录聚合酶链反应方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约666bp的片段,构建重组真核表达质粒PVAX1/M。体外转染COS-7细胞,细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达后,肌肉注射免疫Balb/c小鼠(雌性,6周龄),加强免疫3次后,测定其诱导免疫应答的能力。结果:构建的重组质粒经酶切及测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;细胞免疫化学方法均显示重组质粒可在COS-7细胞中表达有免疫原性的SARS-CoVM蛋白;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体,并能诱导特异性的CTL反应。结论:成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS-CoVM,并能诱导小鼠产生特异性的免疫应答,为SARS的预防康复提供了可能的治疗手段。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

一种快速检测甲型流感病毒的方法

目的 开发一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法（GICA）的试剂盒，以用于对甲型流感病毒的检测。方法以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被两种抗甲型流感病毒单克隆抗体的混合液，制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合，后移动至硝酸纤维素上与固定的单克隆抗体发生反应，形成肉眼可见的红色带。结果GICA试纸条与甲1型和甲3型流感病毒共16种毒株均能发生特异性反应，与乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒无交叉反应。用三种不同甲型流感病毒毒株的不同浓度标本与美国同类经过FDA批准的产品比较，灵敏度相同。结论GICA试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求，并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点，对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。