靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的第三代嵌合抗原受体的构建与表达

目的：构建第三代靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）的嵌合抗原受体表达载体,为肿瘤过继免疫治疗提供实验基础。方法：运用分子克隆方法将嵌合抗原受体的胞外抗原结合区（EGFRvⅢ单克隆抗体的轻链和重链可变区,EGFRvⅢscFv,726 bp）、铰链区/穿膜区（213 bp）、共刺激分子（CD28和CD137的胞内信号区,123 bp和126 bp）和免疫受体酪氨酸活化基序（CD3ζ链,336 bp）连接成EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ（EGFRvⅢ/3CAR）,克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,转染293T细胞48 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting检测EGFRvⅢ/3CAR的表达。结果： EGFRvⅢscFv和基因合成的CD28-CD137-CD3ζ表达框通过重叠延伸PCR拼接成EGFRvⅢ/3CAR,限制性内切酶片段分析和DNA测序均验证了重组载体序列完全正确,Western blotting应用抗人-CD3ζ抗体检测到EGFRvⅢ/3CAR在293T细胞中的完整表达（相对分子质量约58 kD）。结论：成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢ/3CAR表达载体,为嵌合抗原受体修饰T细胞靶向治疗肿瘤提供研究基础。