CD40激发对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响

目的 观察重组人可溶性CD40配体（rhsCD40L)及CD40L基因转染细胞（CD40L-TC）对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响，探讨rhsCD40L在肿瘤生物治疗中的可能作用。方法 利用基因工程技术获得了rhsCD40L和CD40L-TC，分别与恶性B淋巴细胞株XG2，XG7，U266，8226，Raji及Daudi共同作用，分析了CD40激发对肿瘤细胞的体外增殖（锥虫蓝计数法），细胞周期（碘化丙锭掺入法），细胞表面共刺激分子的表达（免疫荧光标记法）以及细胞凋亡（Anexin-V-ETTC法）的效应。结果 （1）恶性B淋巴细胞株CD40表达呈异质性，XG2高表达CD40，8266，Raji和Daudi中度表达，而XG7和U266不表达CD40。显微镜下观察发现，rhsCD40L(5μg/ml）可引起XG2或Daudi细胞的同型聚集，该效应在作用6-8h后即可出现；与CD40L-TC细胞共育后（肿瘤细胞；CD40L-TC=5：1），XG2，Raji和Daudi细胞可粘附于CD40L-TC表面；（2）rhsCD40L和CD40L-TC均可显著抑制XG2，Raji和Daudi细胞的体外增殖，导致XG2细胞呈现G1期阻滞，而Raji和Daudi细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞11.6%和8.9%,Daudi14.2%和15.9%;(3)表型分析显示；rhsCD40L/CD40L-TC可明显上调XG2,Raji和Daudi细胞CD95的表达水平以及Raji细胞CD80的表达，而下调Raji细胞CD18的表达。结论 rhsCD40L能直接并显著地抑制恶性B淋巴瘤细胞株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激分子CD80的表达，具有膜型CD40L的同样生物学功能，故rhsCD40L具有潜在的抗恶性B淋巴细胞肿瘤的作用。     

CXCR4在人多发性骨髓瘤细胞的表达及对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的　探讨CXCR4在多发性骨髓瘤 (MM)细胞上的表达和CXCR4 SDF 1α相互作用对MM肿瘤细胞生物行为及ICAM 1表达的影响。方法　采用免疫荧光标记和流式细胞仪表型检测分析MM细胞上CXCR4和粘附分子的表达 ;采用体外微孔隔离室实验进行SDF 1诱导的MM细胞迁移实验 ;ELISA方法测定血浆中sICAM 1的水平。结果　①新鲜MM细胞及MM细胞株不同程度地表达功能性CXCR4 [(5 0 .4± 2 7.3) % ],其表达水平与体外对SDF 1α诱导的迁移能力 [(2 3.6± 17.2 ) % ]密切相关 (P <0 .0 1) ;②SDF 1α可上调MM细胞表达粘附分子ICAM 1,ICAM 1的表达和可溶性ICAM 1的产生与CXCR4表达有一定相关性。结论　SDF 1α CXCR4对介导粘附分子的调节效应在MM细胞的生物行为中起重要的作用。     

可溶性CD40在肝病患者血清中的表达及其临床意义

目的:研究可溶性CD40(solubleCD40,sCD40)在急性肝炎、重型肝炎和原发性肝癌患者血清中的表达,探讨其与生化指标和疾病预后的关系。方法:使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测急性肝炎(49例)、重型肝炎(22例)和原发性肝癌(13例)患者入院次日清晨空腹血清标本和健康体检者(44例)血清标本中sCD40浓度,分析其与急性肝炎患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的关系,并初步探讨sCD40水平与重型肝炎患者疾病预后的关系。流式细胞术检测患者血清sCD40与CD40配体(CD40L)的结合活性。结果:三种肝脏疾病患者血清中sCD40水平(149.70±86.82)pg/mL较健康对照组(47.33±27.49)pg/mL显著升高(P<0.001),但各组患者之间无统计学意义(P=0.475)。重型肝炎死亡患者血清sCD40浓度较存活患者显著升高(P<0.05)。急性肝炎患者血清sCD40浓度与ALT、AST水平呈显著正相关(r=0.50,P<0.001;r=0.47,P<0.01)。体外实验显示患者血清sCD40具有与CD40L结合的活性。结论:肝脏疾病患者血清异常高表达sCD40,这是评价急性肝细胞损伤的辅助指标,有助于判断重型肝炎患者的病情和预后。CD40-CD40L作用可能参与了肝细胞损伤和免疫失调的病理过程。     

一株识别CD40分子新位点的单克隆抗体研制及生物学特性鉴定

目的：研制识别CD40分子新位点的单克隆抗体（mAb）。方法：以转人CD40转基因细胞L929-CD40为免疫原，常规免疫6—8周龄的雌性BALB／c小鼠；采用B淋巴细胞融合技术，将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2／0融合，以L929-CD40转基因细胞为抗体筛选阳性细胞，经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养；采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该mAb的亚类及抗原识别位点；采用MTT法分析mAb在体外对肿瘤细胞的促增殖效应、ELISA法测定细胞因子分泌以及PI染色分析细胞周期。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人CIM0mAb的杂交瘤细胞株（命名为286），该mAb能特异性地识别人CD40分子并较好的识别肿瘤细胞株H08910表达的CD40分子并能够体外促进肿瘤细胞增殖。结论：成功地研制1株识别CD40新位点mAb，该mAb能够很好地识别肿瘤细胞表达的CD40分子并具有体外促进肿瘤细胞生长的作用。     

阳离子交换一步层析法纯化抗gp130单克隆抗体

目的:建立从小鼠腹水中纯化抗gp130单克隆抗体(mAb)B-S12的一步层析方法。方法:小鼠mAb腹水样品经离心后,进行阳离子交换层析柱纯化。检查了上样缓冲液的pH值和洗脱液的离子强度梯度对mAb纯度的影响。纯化后mAb的生物学活性用MTT比色法检测。结果:在pH4.0、20mmol/LHEPES缓冲液条件下上样,用0～1.0mol/L的NaCl梯度洗脱,可获得纯度超过90%的mAbB-S12,回收率为52%。纯化后的mAb对XG-2细胞有明显的促增殖作用。结论:建立的一步纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高及生物学活性好。     

可溶性CD40酶联检测试剂盒的研制及其检测的临床意义

目的 :建立灵敏、特异和稳定的人可溶性CD4 0 (sCD4 0 )酶标检测试剂盒及探讨其检测的临床意义。方法 :采用该室制备的鼠抗人CD4 0单抗 5C11作为包被抗体 ,另一株识别不同抗原位点的单抗 3G3经生物素 (biotin)标记后作为检测抗体 ,建立双单抗夹心的人sCD4 0酶标检测方法和对各种质控参数进行优化。在此基础上测定了健康供血员、甲亢、慢性肾炎、白血病、类风湿性关节炎患者的血清、肺癌患者血清和胸水及多种多发性骨髓瘤 (MM)、淋巴瘤细胞株培养上清中sCD4 0的含量。结果 :成功地研制了人sCD4 0酶联检测试剂盒 ,其灵敏度为 15 6pg ml。该试剂盒 4℃放置 3个月 ,离散度 (CV) <± 7 9% ,回收率为 95 %～ 114 % ,提示检测方法具有良好的灵敏度、稳定性和准确性。用该试剂盒测得血清中sCD4 0含量的 95 %正常值范围 (x±s)为 10 5 0 0± 18 88pg ml,甲亢、慢性肾炎、白血病、类风湿患者的血清、肺癌患者血清和胸水中sCD4 0的含量明显高于正常对照组 (P <0 0 1)。结论 :成功地研制了检测人sCD4 0酶标检测试剂盒 ,对一些与CD4 0分子表达或信号异常的疾病患者外周血检测结果显示 ,该试剂盒在临床检测中具有潜在的应用价值     

分泌独特型免疫球蛋白BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤模型的建立

目的： 构建分泌独特型免疫球蛋白(idiotype, Id) 的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞株，建立动物模型，为进一步开展Id树突状细胞(dendritic cell, DC)疫苗的免疫治疗提供物质基础。 方法： 采用降植烷和不完全弗氏佐剂间隔致敏6～8周龄BALB/c小鼠，继而采用细胞融合技术、ELISA法、免疫荧光标记和流式细胞术(flow cytometry, FCM) 筛选获得分泌Id的阳性克隆；体内诱生腹水和体外无血清培养法制备Id，优球蛋白沉淀法结合凝胶Suphecray200过滤纯化Id；建立荷瘤模型，从荷瘤小鼠骨髓前体细胞诱导DC。 结果：获得2株稳定分泌Id的BALB/c小鼠B细胞淋巴瘤细胞SB4和SB5，Id均为IgM/κ；成瘤率均为100%，荷瘤小鼠平均生存期为（30±4） d。 结论： SB4和SB5能持续稳定分泌非自身反应性Id，具有良好的成瘤性和高转移率。     

重组人sCD40L功能性片段在大肠杆菌中的表达

目的 克隆sCD40L功能性片段(E107-L261)基因并在大肠杆菌体系进行表达。方法 从CD40L胞外段全长基因通过PCR方法扩增出sCD40L功能性片段(E107-L261)的基因，并在其N端融合6个组氨酸(His)；经PCR、酶以及DNA测序证实；将融合得到的sCD401L基因插入pET30a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果 构建了pET30a-sCl340L原核表达载体；将转化菌BL21(DE3)诱导表达后经SDS-PAGE电泳以及Western Blotting鉴定显示在18kd处有sCD40L功能性片段(E107-L261)的高效表达。结论 sC1340L功能性片段基因的克隆及其表达为进一步研制其同源三聚体形式的功能性重组蛋白奠定了基础。     

CD40分子在肺癌中的表达及其临床意义

目的　探讨CD4 0分子在肺癌中的表达及临床应用价值。方法　外科手术切除标本5 1例 ,采用免疫组织化学法检测肺恶性肿瘤组织中CD4 0分子的表达 ,并分析CD4 0表达水平高低与临床分期和病理分级的相关性。同时采用直接免疫荧光标记和流式细胞仪测定 10例新鲜肺癌和 4株肺癌细胞株膜表面CD4 0分子的表达率。结果　 (1)免疫组化结果显示CD4 0在肺癌组织中的阳性表达率为 76 5 % ,强阳性表达率 5 4 9% ,明显高于正常肺组织 (P <0 0 1)。 (2 )直接免疫荧光标记和流式细胞仪测定CD4 0分子在新鲜肺癌细胞和肺癌细胞株中的表达率分别为 1 6 %～ 71 0 %和2 1%～ 88 2 %。 (3)CD4 0阳性表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移显著相关 (P <0 0 5 ) ,但与肺癌的病理组织学分级及病理类型等无明显相关 (P >0 0 5 )。结论　CD4 0在肺癌发病过程中可能起重要的作用 ,其阳性表达可作为肺癌预后判断及淋巴结转移监测的有价值指标之一     

阴离子交换层析法纯化gp130单克隆抗体B-S12

目的：建立一种从小鼠腹水中获得高纯度、活性好、纯化过程易于放大的抗gp130单克隆抗体B-S12的纯化方法。方法：经硫酸铵沉淀等预处理后的腹水样品，在阴离子交换层析柱上进行分离纯化，用MTT法检测纯化后抗体的生物学活性。结果：腹水样品经硫酸铵沉淀、PBS复溶，用pH 7．0、20mmol／L Tris—HCl缓冲溶液稀释10倍后上强阴离子交换层析柱，NaCl梯度洗脱，可获得纯度大于95％的B-S12抗体，回收率达73％，在体外对XG-2细胞有明显的促增殖作用。结论：建立了快速高效从小鼠腹水中纯化B-S12的方法，为该抗体的进一步应用提供了必要的实验基础。