蛋白酶激活受体2与表皮黑素转运

蛋白酶激活受体2属于耦联G蛋白受体家族的蛋白,它是一种存在于多系统的多功能分子,参与腺体分泌、平滑肌收缩、痛觉、组织纤维化等多种生理及病理过程。在表皮黑素单位中,蛋白酶激活受体2激活后以Rho依赖性吞噬作用介导黑素转运,在表皮的黑素转运、紫外线照射后皮肤色素加深、炎症及炎症后皮肤色素沉着中发挥重要调节作用。     

Th17和Treg细胞与蕈样肉芽肿相关性研究

目的 探讨调节性T（Treg）细胞和Th17细胞在蕈样肉芽肿不同分期中的变化。 方法 流式细胞仪检测28例蕈样肉芽肿、13例大斑块型副银屑病、17例扁平苔藓患者及10例健康对照外周血Treg细胞和Th17细胞百分率,同时应用免疫组化法检测40例蕈样肉芽肿、13例副银屑病、17例扁平苔藓及10例健康对照蜡块组织中叉头状转录因子P3（FOXP3）和白细胞介素17（IL-17）的表达。 结果 蕈样肉芽肿、副银屑病、扁平苔藓患者外周血Treg细胞百分率分别为（8.09 ± 1.68）%,（6.53 ± 1.67）%,（2.84 ± 1.16）%较健康对照［（1.01 ± 0.35）%］升高,差异均有统计学意义。蕈样肉芽肿、副银屑病患者外周血Treg细胞百分率亦高于扁平苔藓（均P < 0.05）;蕈样肉芽肿与副银屑病患者差异无统计学意义（P > 0.05）。外周血Th17细胞百分率在蕈样肉芽肿较副银屑病、扁平苔藓患者比健康人升高［（3.22 ± 0.82）%比（2.46 ± 0.79）%,（1.38 ± 0.47）%和（0.59 ± 0.30）%,均P < 0.05］。FOXP3阳性率在蕈样肉芽肿、副银屑病及扁平苔藓均高于正常皮肤组织［（14.94 ± 4.46）%,（11.95 ± 4.72）%,（6.32 ± 2.81）%比（3.43 ± 1.79）%,均P < 0.05］,蕈样肉芽肿及副银屑病比扁平苔藓高（均P < 0.05）,蕈样肉芽肿比副银屑病差异无统计学意义（P > 0.05）。IL-17阳性率在蕈样肉芽肿、副银屑病、扁平苔藓和正常组织中分别为（15.89 ± 4.27）%,（12.02 ± 3.34）%,（4.84 ± 1.93）%和（2.62 ± 0.89）%,其中,蕈样肉芽肿均高于副银屑病、扁平苔藓组织及正常组织（均P < 0.05）。蕈样肉芽肿、副银屑病外周血Th17/Treg细胞比率比扁平苔藓、健康对照低（0.41 ± 0.11,0.39 ± 0.12比0.50 ± 0.06,0.57 ± 0.19（均P < 0.05）。早期蕈样肉芽肿Th17细胞与Treg细胞呈正相关（r = 0.423,P < 0.05）,肿瘤期蕈样肉芽肿Th17细胞有所下降,而Treg细胞继续升高,但蕈样肉芽肿各期差异无统计学意义,且二者在肿瘤期无相关性。 结论 Treg和Th17细胞失衡可能参与了蕈样肉芽肿的发生与发展。     

蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶在烟酸保护的HaCaT细胞抵抗中波紫外线损伤中的作用

目的 探讨烟酸保护由UVB诱导的角质形成细胞损伤的胞内信号传导分子机制。 方法 UVB照射和烟酸处理HaCaT细胞,TUNEL法检测细胞凋亡,Western印迹检测蛋白激酶B（Akt）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白Akt、P38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平变化。ELISA检测细胞分泌内皮素1（ET-1）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的水平。结果 Western印迹结果表明,UVB照射和烟酸处理HaCaT细胞后,p-Akt、p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白在60 min内都显著激活（P < 0.01）。烟酸预处理后的HaCaT细胞再经UVB照射,可以发现p-Akt、p-P38、p-ERK1/2信号分子在2 h内激活更显著（P < 0.01）。３个抑制剂加UVB照射组较3个单独抑制剂组ET-1、bFGF表达降低,差异均有统计学意义,其中LY294002组、SB203580组ET-1、bFGF水平最低;烟酸预保护的抑制剂处理组HaCaT细胞在UVB照射后,LY294002和U0126组没有出现ET-1、bFGF水平回升,SB203580组bFGF水平出现回升。结论　Akt信号分子在烟酸保护的HaCaT细胞抵抗UVB损伤中起一定的调控作用。     

蛋白酶激活受体2与表皮黑素转运

蛋白酶激活受体2属于耦联G蛋白受体家族的蛋白，它是一种存在于多系统的多功能分子．参与腺体分泌、平滑肌收缩、痛觉、组织纤维化等多种生理及病理过程。在表皮黑素单位中，蛋白酶激活受体2激活后以Rho依赖性吞噬作用介导黑素转运，在表皮的黑素转运、紫外线照射后皮肤色素加深、炎症及炎症后皮肤色素沉着中发挥重要调节作用。     

InnVit基因沉默对黑素细胞B10BR黑素合成和细胞凋亡的影响

目的观察siRNA抑制InnVit基因后对小鼠永生化B10BR黑素细胞黑素合成和细胞凋亡的影响,进一步探讨InnVit基因的生物学功能。方法将InnVit基因的三对siRNA转染B10BR黑素细胞,半定量RT-PCR检测InnVit基因抑制后对黑素细胞InnVit基因mRNA水平的变化;采用MTT法测定InnVit基因抑制后对细胞增殖率的影响;采用流式细胞仪检测InnVit基因抑制后对黑素细胞凋亡的影响。结果siRNA1转染后,InnVit基因在黑素细胞中的表达明显下降,试验组细胞的早期凋亡率(35.80%)较对照组(6.47%)明显增加。结论通过RNA干扰技术可抑制InnVit在黑素细胞中的表达,可诱导B10BR细胞的凋亡增加。     

InnVit基因对B10BR细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 分析InnVit基因的抑制和过表达对永生化黑素细胞株B10BR细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨InnVit基因的生物学功能及其对白癜风中黑素细胞缺失的影响。方法 化学合成InnVit基因特异性siRNA片段以及构建过表达质粒载体P3XF-P120,lipofectamineTM 2000脂质体方法转染B10BR细胞。半定量RT-PCR法检测InnVit基因mRNA水平;Western印迹检测该蛋白水平变化;MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞技术分析细胞周期和凋亡的变化。结果 InnVit基因抑制后mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,InnVit基因过表达质粒组mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;转染后24、48、72 h抑制组的细胞存活量极显著下降（P < 0.01）,过表达质粒组的细胞存活量在48和72 h极显著增加（P < 0.01）。转染后48 h基因抑制组的早期凋亡率从（10.24 ± 1.00）%升至（37.34 ± 3.26）%,过表达质粒组早期凋亡率从（14.58 ± 1.49）%降至（8.43 ± 0.86）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）;转染48 h基因抑制组的G1期细胞由（56.11 ± 5.46）%增至（69.76 ± 6.08）%（P < 0.05）,过表达质粒组的G1期细胞由（55.14 ± 5.65 ）%降至（29.33 ± 3.01）%（P < 0.01）。结论 InnVit基因抑制使细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡;InnVit基因的过表达增强了细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡。其增殖能力的改变可能是通过细胞周期的调控调节的。     

Nogo-66多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备抗中枢神经系统（CNS）突起再生抑制因子Nogo胞外段Nogo-66的多克隆抗体，以进行Nogo分子检测和功能研究。方法 采用原核系统表达来源于大鼠的GST-Nogo-66融合蛋白，经纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体，采用免疫印迹、免疫组织化学和细胞培养技术对该抗体的特异性及生物学活性进行鉴定。结果 获得了高效价的1：10000兔抗大鼠Nogo-66多克隆抗体，该抗体能够识别原核表达的Nogo分子，大鼠脊髓切片的免疫组织化学结果显示，Nogo分子在神经元和少突胶质细胞中有广泛表达；并能阻断Nogo分子对PC12细胞突起生长的抑制作用，具有一定的生物学活性。结论 制备了能识别天然Nogo分子，并具有良好生物学活性的抗Nogo-66多克隆抗体，为检测Nogo分子和进一步研究其功能提供了有力的工具。     

全乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯对氧化应激导致黑素细胞损伤的保护作用研究

目的 研究全乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯（AcEGCG）对H2O2诱导的人表皮黑素细胞损伤的保护作用,探讨其可能的作用机制。 方法 体外培养人表皮黑素细胞,采用H2O2诱导细胞损伤模型。实验分对照组、H2O2组、不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）组和AcEGCG组。MTS法测定细胞存活率,LDH测试盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的漏出量,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的表达水平;Western印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达情况。多个样本均数比较采用单因素方差分析,各样本间多重比较采用SNK-q检验。 结果 与对照组相比,H2O2处理组黑素细胞存活率明显降低（22.99% ± 0.53%,P < 0.01）,细胞内LDH漏出量增加（36.58% ± 0.73%,P < 0.01）,细胞内ROS水平明显升高（19.08 ± 0.57,P < 0.01）,caspase-9和caspase-3表达升高（分别为2.65 ± 0.079和2.36 ± 0.057,均P < 0.01）。与H2O2组相比,细胞存活率在10、20、40 μmol/L AcEGCG组（79.50% ± 3.62%、86.52% ± 5.13%、97.81% ± 5.21%）及EGCG组（43.19% ± 1.68%、63.34% ± 3.60%、70.82% ± 2.1%）明显增加（均P < 0.01）,caspase-9分别降低为1.44 ± 0.067、1.26 ± 0.059、1.10 ± 0.072及2.31 ± 0.085、2.13 ± 0.091、1.35 ± 0.064,caspase-3分别降低为1.70 ± 0.053、1.57 ± 0.057、1.24 ± 0.068及2.09 ± 0.076、1.98 ± 0.093、1.79 ± 0.056,差异均有统计学意义（P < 0.05）;LDH含量均明显下降（P < 0.01）;40 μmol/L AcEGCG或EGCG处理后,ROS含量明显下降（均P < 0.01）。 结论 AcEGCG对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,且显著优于EGCG,可能通过清除自由基、抗氧化、降低caspase-9及caspase-3表达等途径发挥作用。     

蕈样肉芽肿白细胞介素13及其受体表达

目的 探讨白细胞介素13(IL-13)及其受体在蕈样肉芽肿(MF)皮损中的表达及临床意义.方法 2010年1月至2016年3月收集杭州市第三人民医院皮肤科经临床、病理、免疫表型和(或)T细胞受体基因重排检测确诊的MF石蜡组织标本34份,IA期5例,IB期9例,ⅡA期17例和ⅡB期3例.选择正常皮肤组织10份作为对照.应用免疫组化方法分别检测IL-13、IL-13Rαl及IL-13Rα2的表达.结果 IL-13、IL-13Rα1和IL-13Rα2表达于各期MF皮损组织的异形淋巴样细胞和亲表皮性淋巴样细胞,IL-13Rα2几乎高表达于所有的MF皮损组织.正常皮肤组织及淋巴细胞均不表达IL-13及其受体.随着MF病程的进展,皮损组织IL-13及其受体表达率升高.IL-13、IL-13Rαl及IL-13Rα2的表达率在Ⅰ期MF皮损(分别为10.00％±3.14％、21.43％±6.88％、31.14％±6.38％)均显著低于Ⅱ期MF皮损(分别为27.50％±11.00％、39.45％ ± 9.43％、44.40％±11.15％),差异均有统计学意义(P＜0.05),但在ⅠA期与ⅠB期之间以及ⅡA期与ⅡB期之间差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 IL-13及其受体尤其是IL-13Rα2有望成为MF早期诊断和生物学行为预判的标志物.     

窄谱中波紫外线联合干扰素治疗蕈样肉芽肿疗效及其与Treg/Th17细胞相关性研究

目的 观察窄谱中波紫外线（NB-UVB）单独或联合干扰素治疗覃样肉芽肿（MF）的疗效,探讨外周血调节性T（Treg）细胞和辅助性T细胞17（Th17）细胞与疗效的相关性。 方法 33例ⅠA期-ⅡA期MF患者按照治疗方法分为两组,分别应用NB-UVB单独照射（照射组）和NB-UVB照射联合重组人干扰素（INF）-α-2b肌内注射（联合组）治疗。于治疗前和治疗9个月后分别采集患者外周血,流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞百分率。以10例健康人外周血为对照组（健康对照组）。 结果 平均治疗时间9个月,照射组15例中,完全缓解6例,部分缓解3例,无效6例,联合组18例中,完全缓解12例,部分缓解5例,无效1例,联合治疗效果显著优于单独治疗（P = 0.023）。治疗前两组患者外周血 Treg和Th17细胞百分率均明显高于健康人（均P < 0.05）,两患者组间差异无统计学意义（P > 0.05）;治疗后两患者组Treg和Th17细胞百分率均显著下降,但仍高于健康对照组（均P < 0.05）。联合组Treg和Th17细胞降幅均大于照射组（均P < 0.05）。7例治疗无效患者治疗后外周血Treg细胞较治疗前亦有降低（P < 0.05）,Th17细胞无显著下降（P > 0.05）。 结论 NB-UVB照射联合INF-α-2b肌内注射治疗MF临床疗效优于单独使用NB-UVB,疗效可能与外周血Treg和Th17细胞降幅有关。