Brn3b基因对视神经损伤条件下视网膜神经节细胞的保护作用

目的　探讨Brn3b过表达对视神经损伤条件下视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的保护作用。方法　选取雄性健康成年BALB/c小鼠60只，用微型视神经夹将小鼠右眼球后视神经夹持损伤，按视神经损伤后的天数依次分为第1、3、5、7、14天组，小鼠左侧正常眼作为空白组，明确视神经损伤天数条件。选取雄性健康成年BALB/c小鼠40只，用微量进样器以小鼠右眼玻璃体内注射的方法将腺相关病毒载体转染小鼠视网膜，建立Brn3b过表达模型并分组:Brn3b过表达组［转染Brn3b过表达腺相关病毒载体（Brn3b overexpressed adeno-associated viral vector，AAV-CMV-Brn3b）］和阴性对照组［转染空白腺相关病毒载体（blank adeno-associated viral vector，AAV-CMV-GFP）阴性对照物］，每组20只；之后，取Brn3b过表达组和阴性对照组各10只，用微型视神经夹将小鼠右眼球后视神经夹持损伤，构建模拟小鼠视神经损伤（controlled optic nerve crush，CONC）模型并分组:CONC-Brn3b过表达组和CONC-阴性对照组。利用视网膜铺片和切片免疫荧光标记相关蛋白表达量，检测Brn3b过表达对视神经损伤条件下RGCs、Brn3b和Caspase3蛋白表达的影响，并对其共定位情况做出统计分析。结果　与阴性对照组相比，Brn3b过表达组小鼠视网膜Brn3b的表达水平明显增加。在小鼠CONC模型制作后的第7天RGCs的总凋亡数量达到65%，第14天RGCs的凋亡数量未见进一步改变。免疫荧光标记的蛋白表达量及其共定位分析显示，在视神经损伤条件下，与CONC-阴性对照组相比，CONC-Brn3b过表达组小鼠RGCs的凋亡量以及凋亡因子Caspase3的表达量均明显减少，差异均有统计学意义（均为P＜0.001）。结论　Brn3b基因对视神经损伤条件下RGC具有明确的保护作用，Brn3b基因对凋亡因子Caspase3的表达可能具有一定的抑制作用。     

橙皮苷对翼状胬肉成纤维细胞增殖及cyclin D表达的影响

目的：评价橙皮苷对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖的抑制作用及对周期蛋白D(cyclin D)表达的影响。

方法：将人翼状胬肉新鲜组织进行体外贴壁细胞常规培养,并采用免疫荧光染色法进行鉴定。通过MTT法检测不同浓度丝裂霉素C(MMC)(1.5、7.5、30.0μmol/L)和橙皮苷(24、48、64、72、96、120μmol/L)作用不同时间(24、48、72h)对细胞增殖的抑制,筛选适宜的作用浓度和时间。采用Western blot法检测cyclin D在HPF细胞中的相对表达量。

结果：分别采用48、72μmol/L橙皮苷和7.5μmol/L MMC作用于HPF细胞48h,Western blot检测结果显示,空白对照组(正常培养)、MMC组、48μmol/L橙皮苷组、72μmol/L橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量分别为1.20±0.02、0.60±0.03、0.54±0.02、0.45±0.07(F=73.025,P=0.001),MMC组和橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量均低于空白对照组(P<0.05),但MMC组和橙皮苷组(48、72μmol/L)细胞cyclin D蛋白相对表达量均无差异(P>0.05)。

结论：橙皮苷能抑制翼状胬肉HPF细胞增殖,该过程与其降低cyclin D的表达有关。     

橙皮苷对人翼状胬肉成纤维细胞增生的抑制作用

目的　评价橙皮苷对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞（human pterygium fibroblasts,HPF）增生的抑制作用,对照观察丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）对HPF的影响,寻找治疗及预防翼状胬肉复发的中医中药方法。方法　将人翼状胬肉新鲜组织剪碎后进行体外贴壁细胞常规培养及传代,并采用波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色及DAPI染色对HPF进行鉴定。用24 μmol·L^-1、48 μmol·L^-1、64 μmol·L^-1、72 μmol·L^-1、96 μmol·L^-1、120 μmol·L^-1橙皮苷及1.5 μmol·L^-1、7.5 μmol·L^-1、30.0 μmol·L^-1 MMC作用于第3代HPF,24 h、48 h、72 h后采用MTT法检测细胞的增生抑制率,并筛选合适的浓度梯度及时间进行细胞凋亡检测,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果　根据MTT法检测细胞增生抑制率的结果,选用72 μmol·L^-1及48 μmol·L^-1 的橙皮苷作为实验组,将7.5 μmol·L^-1 MMC作为MMC标准对照组,无处理细胞作为空白对照组,培养48 h后流式细胞仪检测HPF的凋亡率。结果显示,72 μmol·L^-1橙皮苷组、48 μmol·L^-1橙皮苷组、7.5 μmol·L^-1 MMC标准对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为（41.10±1.04）%、（24.97±3.70）%、（48.60±6.94）%及（9.20±4.67）%,各组间HPF凋亡率整体存在差异（F=43.581,P<0.001）,两两比较结果显示,除72 μmol·L^-1橙皮苷组与MMC标准对照组间差异无统计学意义（P>0.05）外,其余组间两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　72 μmol·L^-1橙皮苷在抑制HPF生长方面有着与MMC等同的效果,主要是通过促进HPF凋亡进而抑制HPF的增生。     

去水淫羊藿素对大鼠视网膜缺血/再灌注损伤的保护作用

目的 研究去水淫羊藿素(ICT)对大鼠视网膜缺血/再灌注损伤是否具有保护作用,并初步探讨其作用机制.方法 将40只SD大鼠采取随机数表法分为5组(n=8),通过夹闭一侧颈总动脉的方法构建大鼠视网膜缺血/再灌注(I/R)模型.分别于夹闭前,一次性经腹腔注射不同剂量(1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg)ICT;假手术组及模型组给予等体积生理盐水腹腔注射;假手术组只分离不夹闭,模型组与药物组建立视网膜I/R模型.各组分别在夹闭前、缺血30 min时行视网膜电流图(ERG)、眼底照相检查以及再灌注1 h后行ERG、眼底荧光血管造影(FFA)检查.再灌注6 h后获取视网膜,通过免疫印迹法检测白介素10(IL-10)蛋白表达水平.结果 与模型组比较,ICT治疗组能显著改善ERG的a波、b波振幅降低,使后极部视网膜缺血动脉明显扩张,并且能升高视网膜I/R损伤后视网膜组织IL-10蛋白表达水平[(1.02±0.44)vs(0.47±0.21)],差异有统计学意义(P<0.05).结论 ICT对视网膜缺血/再灌注损伤具有保护作用,其保护机制可能与上调抗炎细胞因子IL-10蛋白表达水平,抑制炎症反应有关.