Lactacystin诱导PC12细胞胞内嗜酸性包涵体动态变化的研究

目的 研究蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞胞浆内嗜酸性包涵体的动态变化过程.方法 PC12细胞中加入不同浓度lactacystin(0、5、10、20μmol/L),孵育24 h后行HE染色及α-synuclein免疫组织化学染色,光镜观察包涵体变化;其中10 μmol/L lactacystin组分别于加入lactacystin后24、36、48、72、96和120 h行上述染色法,光镜观察包涵体变化.结果 lacatacystin作用于PC12细胞24 h后,HE染色显示随着浓度增加.胞浆中嗜伊红包涵体数量逐渐增多.0 μmol/L组胞浆中未看到包涵体,5 μmol/L组胞浆中有少量包涵体出现(3.33%±1.15%),10μmol/L组多数细胞胞浆出现典型球状包涵体(71.33%±4.16%),20μmol/L组几乎每个细胞胞浆中均出现嗜伊红包涵体(90.33%±3.21%),个别包涵体游离于细胞外;10 μmol/L组随着时间延长,包涵体逐渐从胞浆中游离至细胞外,其后胞浆逐渐缺失,在96 h和120 h时仅剩余胞核和球状包涵体.免疫组化染色显示:lactacystin作用24 h时,胞浆中α-synuclein免疫反应阳性物质逐渐由散在颗粒逐渐聚集成球状包涵体;随着浓度的增加和时间延长,α-synuclein染色阳性的球状包涵体游走于细胞外,胞浆逐渐缺失,至96 h和120 h时仅剩余胞核和包涵体.结论 lactacystin作用于PC12细胞后,早期在胞浆中出现散在的嗜酸性和α-synuclein免疫反应阳性的颗粒,随着浓度增加和时间延长,颗粒状物质在核旁聚集,最终形成固缩的包涵体,细胞外包涵体可独立存在.这种包涵体的动态变化过程与以人类帕金森病为代表的神经变性疾病中的包涵体非常相似,可以作为研究包涵体相关问题的有力工具.     

Lactacystin诱导PC12细胞致帕金森病的实验研究

目的应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin构建帕金森病细胞模型,从泛素-蛋白酶体功能角度探讨帕金森病的发病机制。方法Lactacystin(0、5、10、15和20μmol/L)分别处理PC12细胞24h,MTT法检测细胞活力;HE染色观察包涵体生成;免疫组织化学法观察α-synuclein在胞内聚集情况;AO/EB双染及电镜检测细胞凋亡。结果10μmol/L Lactacystin作用24h后细胞活力开始显著低于对照组(P<0.01),随着浓度大,细胞活力进一步下降,呈浓度依赖性(P<0.01);HE染色显示胞浆核周出现圆形或椭圆形嗜伊红的包涵体;免疫组化显示包涵体α-synuclein染色呈强阳性;10μmol/L Lactacystin作用细胞24h后AO/EB双染提示细胞早期凋亡;电镜显示细胞核变小偏位,部分胞核固缩、趋边、凝聚。结论Lactacystin对多巴胺能神经元有毒性作用,可形成胞浆内包涵体并诱导细胞凋亡。蛋白酶体功能异常可能在帕金森病发病机制中发挥重要作用。     

蛋白酶体抑制诱导的PC12细胞帕金森病模型

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病(PD)模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72 h后,以MTT法检测细胞活性,荧光染色检测凋亡细胞百分率,HE染色观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果不同浓度PSI作用于PC12细胞24 h时,细胞存活率无变化;作用48~72 h时,1~20μmol/L PSI使细胞存活率分别降至47.03%~58.98%和19.58%~34.72%;凋亡细胞由1.15%升至5.27%。HE染色显示经PSI处理的PC12细胞胞浆内有嗜酸性包涵体出现,透射电镜下细胞呈凋亡的超微结构特点。结论PC12细胞蛋白酶体受抑模拟了PD的两大病理特点,蛋白酶体功能异常可能是PD的发病因素之一,短期抑制PC12细胞的蛋白酶体功能可作为PD的细胞模型。     

蛋白酶体抑制剂诱导的帕金森病模型中galectin-1含量变化的研究

目的检测蛋白酶体抑制剂PSI诱导的帕金森病(PD)细胞模型中,β半乳糖苷结合血凝素(galectin-1)的含量变化及其在PC12细胞内的分布。方法PSI作用于PC12细胞后,荧光染料染色检测细胞凋亡率;HE染色观察细胞形态学变化。对PSI诱导的PD细胞模型进行蛋白质组学研究,应用免疫细胞化学的方法研究galectin-1在PC12细胞内分布,应用免疫印迹的方法研究此模型中galectin-1的含量变化。结果10μMPSI作用于PC12细胞24小时,细胞凋亡比例增加(P<0.05),胞浆内出现了嗜酸性包涵体。蛋白质组学和免疫印迹研究均提示galectin-1的含量在细胞模型组明显减少(P<0.05)。galectin-1主要分布于PC12细胞的胞膜、胞浆及细胞核内。结论蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞,模拟了人类PD,在此模型中galectin-1减少,提示此蛋白可能在PD的发病机制中起作用。     

溶酶体自噬途径降解α—synuclein蛋白作用研究

目的探讨α—synuclein蛋白细胞内溶酶体途径降解机制。方法用神经生长因子NGF诱导分化PCI2细胞作为研究多巴胺能神经元的细胞载体,应用鱼藤酮处理PCI2细胞建立α-synuclein蛋白细胞模型。使用溶酶体途径降解抑制剂E64处理神经元样分化的PCI2细胞,应用免疫荧光双标方法观察PCI2细胞内硫黄素S、α—synuclein蛋白阳性聚集包涵体形成情况,比较各组的差异。结果用E64处理鱼藤酮预处理过的PCI2细胞后α—synuclein蛋白聚集且较多包涵体形成（15．36±0．85）％,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论溶酶体自噬途径可能在α—synuclein蛋白降解、聚集和多巴胺神经元死亡过程中发挥重要作用。     

过氧化氢对多巴胺神经元的选择性损伤作用

目的探讨过氧化氢(H2O2)对多巴胺能神经元的选择性损伤作用。方法用神经生长因子将PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元模型,以N2a细胞作为对照,2组细胞共同经H2O2处理后,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内α-synuclein异常修饰和聚集以及细胞形态改变;PC12细胞经利血平耗竭多巴胺后用H2O2处理,并观察α-synuclein异常修饰和聚集及细胞形态变化。结果H2O2处理的PC12细胞胞浆内逐渐出现泛素化的α-synuclein聚集,细胞轴突回缩消失,胞体变圆、变小,胞核变大,N2a细胞及利血平耗竭多巴胺的PC12细胞经H2O2处理后细胞胞浆内无α-synuclein聚集。结论H2O2能选择性引起多巴胺能神经元胞浆内泛素化α-synuclein蛋白的异常聚集,并导致细胞退行性变,该现象可能与神经元内源性多巴胺有关。     

热休克蛋白对多巴胺能神经细胞的保护作用研究

目的探讨热休克蛋白(HSP)对蛋白酶体抑制剂处理的多巴胺能神经细胞的活力以及细胞内包涵体形成的影响。方法将PC12细胞进行热处理,免疫印迹法鉴定热休克蛋白表达,并确定最佳热处理条件;再应用高选择性的蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理PC12细胞。MTT方法检测细胞活力,免疫荧光细胞化学染色观察细胞内包涵体形成的变化。结果免疫印迹法证实PC12细胞热处理2h后HSP70水平即开始迅速升高,一直持续至24h,其中4h的HSP70水平表达较高,故选其为最佳观察条件。未经热处理的对照组经5μM、10μM、15μM和20μMLactacystin处理24h后,PC12细胞的活力显著降低,呈剂量依赖性;热处理组的细胞活力比对照组显著升高,两者有显著性差异(P<0.01)。免疫荧光染色显示对照组细胞的胞浆内包涵体明显增多,而热处理组胞浆内包涵体明显减少。结论热休克蛋白能显著增强细胞活力,减少细胞内包涵体形成,对多巴胺能神经元可能有一定的保护作用。     

鱼藤酮诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的探讨鱼藤酮对多巴胺能神经元内泛素化-αsynuclein聚集的影响及其细胞损伤作用。方法应用鱼藤酮处理经NGF诱导的神经元样分化的PC12细胞株(多巴胺能神经元)与N2a细胞株(非多巴胺能神经元)4、8、16、24 h以及用利血平预处理PC12细胞4 h再加入鱼藤酮处理16 h;采用免疫荧光双标记方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化-αsynuclein聚集,以MTT法和流式细胞术分别检测PC12细胞活力及凋亡率。结果单用鱼藤酮处理16 h后,PC12细胞株与N2a细胞株相比较,免疫荧光双标记显示PC12细胞内泛素化-αsynu-clein发生明显聚集,并且鱼藤酮对PC12细胞株的作用具有时间依赖性,而N2a细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显。利血平耗竭PC12细胞内多巴胺后再经鱼藤酮处理,PC12细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显;经不同浓度鱼藤酮处理后,细胞活力呈剂量依赖性下降;与对照组相比,经20 nmol/L鱼藤酮处理4、16、24 h后细胞存活率分别为(81.6±12.3)%、(59.8±6.7)%和(52.2±7.4)%(P<0.01)。鱼藤酮处理后出现早期凋亡细胞,随着处理时间的延长细胞凋亡率逐渐上升(P<0.01)。结论鱼藤酮选择性作用于多巴胺能神经元,使细胞内泛素化-αsynuclein发生聚集,而且这种变化具有时间依赖性,最终导致细胞发生凋亡,然而鱼藤酮对非多巴胺能神经元作用不明显。同时,鱼藤酮诱导泛素化-αsynuclein发生聚集的作用与神经元的特性存在密切关系。     

鱼藤酮致大鼠脑内α-突触核蛋白的表达分布变化

目的 研究鱼藤酮所致的帕金森病大鼠的脑内α-突触核蛋白（α—synuclein,ASN）分布。方法 Wistar大鼠随机分成两组,分别给予鱼藤酮和／或溶剂（对照组）皮下注射,4周后取脑组织,对黑质部位HE染色,光镜下观察Lewy小体形态;对黑质、海马、纹状体等脑区进行酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、ASN免疫组织化学染色。结果 在对照组大鼠脑内,ASN广泛分布于各脑区,尤其在皮质、纹状体、海马等纤维投射丰富的区域。鱼藤酮处理的大鼠脑中,黑质TH阳性多巴胺能神经元数目减少、纹状体区TH阳性纤维脱失,黑质部位可见Lewy小体样结构;ASN阳性染色在各个脑区均有增强但各个脑区增强程度不一,黑质部位神经元胞浆和胞核内均有ASN明显聚集,纹状体可见ASN聚集围绕在细胞周围。海马部位偶见ASN在胞浆中点状聚集,胞核中无明显改变。结论 在鱼藤酮皮下注射导致的帕金森病大鼠的脑内,ASN在多个脑区中表达增加,而在黑质纹状体部位聚集最为明显,蛋白分布由多巴胺能神经元的突触末端向胞浆和胞核扩展。     

溶酶体自噬途径降解α-synuclein蛋白作用研究

目的 探讨α-synuclein蛋白细胞内溶酶体途径降解机制.方法 用神经生长因子NGF诱导分化PC12细胞作为研究多巴胺能神经元的细胞载体,应用鱼藤酮处理PC12细胞建立α-synuclein蛋白细胞模型.使用溶酶体途径降解抑制剂E64处理神经元样分化的PC12细胞,应用免疫荧光双标方法观察PC12细胞内硫黄素S、α-synuclein蛋白阳性聚集包涵体形成情况,比较各组的差异.结果 用E64处理鱼藤酮预处理过的PC12细胞后α-synuclein蛋白聚集且较多包涵体形成(15.36±0.85)%,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 溶酶体自噬途径可能在α-synuclein蛋白降解、聚集和多巴胺神经元死亡过程中发挥重要作用.