流式细胞仪分选thy1-GFP-J转基因小鼠皮层及海马神经元

目的获得活体哺乳动物脑内单一纯化的神经元群。方法用RT-PCR和激光共聚焦显微镜扫描脑片鉴定thy1-GFP-J转基因小鼠,取2月龄鉴定阳性小鼠皮层和海马组织,应用番木瓜蛋白酶分离系统制备脑组织单细胞悬液,PI标记死亡细胞,流式细胞仪荧光激活细胞分类技术(FACS)分选收集GFP 和PI-的存活神经元,并抽提获得细胞的RNA和蛋白。结果阳性转基因小鼠DNA的PCR扩增鉴定显示为内参(324bp)和所转基因(173bp)两条带,脑片的激光共聚焦扫描结果显示海马和皮层均可见大小较均一的圆点状绿色荧光。经FACS分选后的细胞几乎全都发出绿色荧光,每次产量约为0.5～1×106个存活神经元。获得的纯化神经元中抽提的RNA和蛋白可用于RT-PCR和westernblot检测。结论利用FACS可以从thy1-GFP-J转基因小鼠脑内获得单一纯化的存活神经元群。该技术的应用将为活体神经元细胞特异性的基因表达和蛋白定量分析研究提供一个可行方案。     

流式细胞仪分选thyl-GFP-J转基因小鼠皮层及海马神经元

目的获得活体哺乳动物脑内单一纯化的神经元群。方法用RTPCR和激光共聚焦显微镜扫描脑片鉴定thyl-GFP-J转基因小鼠，取2月龄鉴定阳性小鼠皮层和海马组织，应用番木瓜蛋白酶分离系统制备脑组织单细胞悬液，PI标记死亡细胞，流式细胞仪荧光激活细胞分类技术（FAcs）分选收集GFP^＋和PI-的存活神经元，并抽提获得细胞的RNA和蛋白。结果阳性转基因小鼠DNA的PCR扩增鉴定显示为内参（324bp）和所转基因（173bp）两条带，脑片的激光共聚焦扫描结果显示海马和皮层均可见大小较均一的圆点状绿色荧光。经FACS分选后的细胞几乎全都发出绿色荧光，每次产量约为0．5～1×10^6个存活神经元。获得的纯化神经元中抽提的RNA和蛋白可用于RT-PCR和westernblot检测。结论利用FACS可以从thyl-GFP-J转基因小鼠脑内获得单一纯化的存活神经元群。该技术的应用将为活体神经元细胞特异性的基因表达和蛋白定量分析研究提供一个可行方案。     

tau蛋白和中枢神经系统变性疾病

tau蛋白是脑内神经元细胞支架蛋白之一。其正常功能是促进微管蛋白组成微管 ,并维持已形成微管的稳定性。参与维持细胞形态、信息传递、细胞分裂等重要生物学过程 ,是轴突生长发育和神经元极性形成的不可缺少因素。近年来发现tau蛋白与一些中枢神经系统变性疾病密切相关。我们将综述此方面的研究进展。一、tau蛋白的生物学结构tau蛋白是一种神经元微管相关蛋白 ,由微管相关蛋白和管蛋白组成的微管是细胞骨架的重要组成成分 ,与细胞有丝分裂、细胞内物质转运等多种功能有关。正常情况下广泛存在于神经元内 ,在脑内主要集中在神经细胞轴突之中…     

β-淀粉样蛋白诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中Tau蛋白的过度磷酸化★

背景：大多数学者认为β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病的始动因素，而Tau蛋白过度磷酸化可能是阿尔茨海默病最重要的分子病理变化之一。 目的：观察β-淀粉样蛋白25~35对大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白磷酸化的影响。 方法：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，将第4代骨髓间充质干细胞分为两组：实验组中加入预诱导培养基和20 μmol/L β-淀粉样蛋白25~35，24 h后用含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟茴醚的DMEM诱导其向神经细胞分化，5 h后收取细胞。对照组诱导方法同实验组，但在诱导过程中未加入β-淀粉样蛋白25~35。 结果与结论：光镜下可见纺锤状的骨髓间充质干细胞诱导后出现长突起，呈现神经细胞样形态，但实验组突起数量和长度均少于对照组；免疫细胞化学法检测两组诱导后的神经元样细胞为神经元特异性烯醇化酶阳性；免疫蛋白印记法证明实验组的GSK-3β、Tau[pSer262]和Tau[pSer396]表达均显著高于对照组。结果提示β-淀粉样蛋白25~35能够通过GSK-3β途径诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白过度磷酸化。     

帕金森病发病机理在猴脑的实验研究

用离体组织受体放射自显影术观察神经毒素甲基－苯基－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）在猴脑内的分布。离体鼠脑切片的孵育结果显示￣３Ｈ－ＭＰＴＰ与脑组织的结合呈饱和性；猴脑放射自显影图像显示￣３Ｈ－ＭＰＴＰ在猴脑内有其特异的结合位点，尤以黑质和纹状体处为多，这些位点能被非标记的ＭＰＴＰ竞争结合。研究提示，脑内可能有与ＭＰＴＰ相结合的某种受体，该受体是ＭＰＴＰ诱导帕金森样症状的重要基础。     

星形胶质细胞多巴胺受体表达特征的分析

分离培养了大鼠脑内多个部位包括大脑皮质、纹状体和中脑的星形胶质细胞,结合应用放射性配体氚标记多巴胺（［３Ｈ］ＤＡ）的放射自显影和放射性配体测定受体分析法,对脑内星形胶质细胞多巴胺受体的表达特性进行了观察和分析。放射性自显影显示受体分布于胞体和枝状突起,且纹状体细胞的受体多于皮质和中脑细胞;［３Ｈ］ＤＡ 与细胞膜制备物结合的Ｓｃａｔｃｈａｒｄ 作图求得放射性配体的解离常数和结合量,发现三个部位来源的星形胶质细胞提取物有五个解离常数,最大结合量与细胞来源的部位有关。结果提示脑内星形胶质细胞多巴胺受体的表达分布广泛,且具有部位异质特性。     

五味子酮对APP转基因鼠神经干细胞分化中Tau蛋白过磷酸化水平的影响

背景：华中五味子酮有强的抗氧化活性,可高效清除羟自由基和超氧阴离子,对处于活性氧应激状态下的细胞具有保护作用。神经元内神经原纤维缠结主要是由异常磷酸化的Tau蛋白组成,与阿尔茨海默病的严重程度呈正相关。 目的：探讨五味子酮在APP转基因小鼠神经干细胞诱导分化成神经细胞的过程中对Tau蛋白磷酸化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-07/2008-10在郑州大学医学实验中心完成。 材料：自中国协和医科大学遗传动物中心购得APP基因突变小鼠30只,五味子酮由河南省中医研究院药物所提供。 方法：剪取新生APP转基因小鼠尾尖,常规提取DNA,采用PCR法检测动物是否携带有APP基因,APP转基因阳性鼠记为“APP+”,APP转基因阴性鼠记为“APP-”。分别取APP+鼠和APP-鼠海马部位脑组织,体外分离培养神经干细胞,并将纯化的神经干细胞向神经细胞方向诱导分化。将从APP+鼠来源的细胞分为五味子酮组、APP+细胞对照组,将APP-鼠来源的细胞设为APP-细胞对照组。五味子酮组向细胞培养液中加入终浓度为50 μmol/L的五味子酮溶液,余2组加入相同容积的PBS,培养24 h。 主要观察指标：免疫荧光化学和免疫印迹分析测定APP+、APP-细胞Tau蛋白在262、396位点的磷酸化水平。 结果：与APP+细胞对照组比较,五味子酮组细胞荧光强度减轻,Tau[Ps262]、Tau[Ps396]的磷酸化水平均降低,且Tau[Ps396]位点的磷酸化水平降低尤为明显。APP-细胞对照组Tau[Ps262]、Tau[Ps396]磷酸化水平均较低。 结论：在APP转基因小鼠神经干细胞诱导分化过程中,五味子酮可以明显降低Tau蛋白在396、262位点的磷酸化水平,减轻神经元损伤,但其磷酸化程度并未达到阴性细胞水平。     

帕金森病发病机理在猴脑的实验研究

用离体组织受体放射自显影术观察神经毒素甲基－苯基－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）在猴脑的内的分布。离体鼠脑切片的孵结果显示＾３Ｈ－ＭＰＴＰ与脑组织的结合呈饱和性；猴脑放射自显影图像显示＾３Ｈ－ＭＰＴＰ在猴脑内有其特异的结合位点，尤以黑质和纹状体处为多，这些位点能被非标记的ＭＰＴＰ竞争结合。研究提示，脑内可能有与ＭＰＴＰ相结合的某种受体，该受体是ＭＰＴＰ诱导帕金森样症状的重要基础。     

活性氮在神经退行性疾病自噬病理环节中的作用

正蛋白质的异常折叠与聚集是神经退行性疾病中常见的共同特征之一,目前,对公认的神经退行性疾病,诸如阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的脑病理学研究发现,神经元淀粉样斑块沉积由错误折叠的β淀粉样肽(amyloid-beta peptide,Aβ)聚集物和含有微管相关蛋白Tau(microtubuleassociated protein Tau,Tau)的神经纤维缠结(neurofibrillary     

T细胞在阿尔兹海默氏病中的研究进展

正阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关性的慢性、进行性和不可逆性神经退行性疾病,其特征是认知和记忆障碍,是最为常见的痴呆类型。AD的病理学改变包括神经元外蛋白片段β-淀粉样蛋白(称为β-淀粉样蛋白,β-amyloid,Aβ)和神经元内蛋白tau蛋白(称为tau缠结)的异常形式的积累~([1])。Aβ的积累会干扰突触中神经元与神经元的通讯,Tau缠结会阻止营养物质和其他必需分子在神经元内部的运输,导致细胞死亡。