核因子κB及相关基因产物的表达

背景：川芎嗪延缓肝纤维化形成的机制尚不清楚。 目的：观察川芎嗪对肿瘤坏死因子α刺激的肝星状细胞增殖及结缔组织生长因子、核因子κB及其相关基因产物白细胞介素6表达的影响。 方法：体外培养HSC-T6细胞株,取对数生长期的细胞用于实验。实验分为4组：对照组仅加入细胞;TNF-α组加入10 μg/L TNF-α;川芎嗪干预组先加入终浓度为10 μg/L的TNF-α作用30 min后,分别加入川芎嗪50,100,200,400,600, 1 000 mg/L;PDTC组先加入终浓度为10 μg/L的TNF-α作用30 min后,再加入终浓度18 μmol/L的核因子κB阻断剂PDTC。 结果与结论：MTT结果显示100,200,400,600,1 000 mg/L的川芎嗪均能抑制HSC-T6增殖,且呈剂量依赖性。免疫细胞化学染色及Western blot检测发现10 μg/L的肿瘤坏死因子α刺激后,HSC-T6细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达明显增多(P < 0.01或P < 0.05),200,400,600 mg/L的川芎嗪及18 μmol/L的PDTC均可明显降低肿瘤坏死因子α刺激后HSC-T6细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达(P < 0.01),且随着川芎嗪质量浓度的增加,抑制作用增强,PDTC的抑制作用最明显。相关性分析结果显示HSC-T6细胞结缔组织生长因子和核因子κB的表达呈正相关(r=0.980,P < 0.01)。说明川芎嗪可以抑制肝星状细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达,抑制肝星状细胞的增殖。     

微囊技术对人嗜铬细胞和小鼠黑色素瘤细胞凋亡的影响*☆

目的：观察海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊对囊内细胞的存活、生长及凋亡的影响，以验证免疫隔离APA微胶囊的生物膜性和生物活性。 方法: 实验于2004-01/05在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验中心完成。取人嗜铬细胞原代培养，小鼠黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞传代培养，将APA微囊分别包裹上述3种细胞并进行培养；根据3种细胞微囊化与否分成6组，利用MTT比色法检测各组细胞存活和生长情况，共观察9 d，并用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。 结果: ①在实验观察的9 d内，人嗜铬细胞、小鼠黑色素瘤细胞和小鼠成纤维细胞可在微囊内以细胞团的形式生长、存活。②MTT比色法检测显示各组囊内细胞与相应组裸细胞的生长、存活情况比较差异无显著性意义（P > 0.05）。③流式细胞仪检测各组囊内细胞与相应组裸细胞的凋亡百分率比较差异亦无显著性意义（P > 0.05）。 结论: 制备的APA微囊化材料及制备方法对细胞活性、生长状况及凋亡情况无不良影响，表明包裹细胞的APA微囊有良好的生物相容性和生物活性。     

微囊化人视网膜色素上皮细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 观察微囊化人视网膜色素上皮(RPE)细胞移植治疗帕金森病(PD)大鼠的疗效. 方法 采用机械分离法和酶消化法原代培养人RPE细胞,传代后用高压静电微胶囊成型装置制作海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞,将其立体定向移植人6-羟基多巴胺(6-OHDA)所致的PD模型大鼠的右侧纹状体.实验分为模型组、裸细胞(RPE)组、空囊对照(APA)组以及微囊化细胞(APA-RPE)组.检测各组大鼠移植前后阿朴吗啡诱导的旋转行为变化和移植后8周纹状体中多巴胺(DA)的含量. 结果 APA-RPE组大鼠在移植后4周阿朴吗啡诱发的旋转次数[(6.25±1.04)r/min]开始减少,与移植前[(12.88±7.34)r/min]相比减少幅度为51.48%,至第8周[(5.87±2.03)r/min]减少更加明显,减少幅度为54.43%,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组[(108.14±1.89)mol/L]比较,APA-RPE组移植后8周[(342.63±28.32)mol/L]大鼠纹状体DA含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而RPE组和APA组未见明显变化. 结论 微囊化人RPE细胞对PD大鼠模型有治疗作用,可作为一种前景良好的治疗PD的方法 进一步研究.     

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢细胞腹腔异体移植以及

背景：应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊技术包裹细胞进行异体移植,被证明是一种可避免受体产生免疫排异的有效方法。 目的：观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化卵巢细胞种植于去卵巢大鼠腹腔后对受体大鼠肾上腺的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-03/2008-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成。 材料：取Wistar大鼠卵巢分离培养卵巢细胞,进行微囊化处理,制备包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊。 方法：将40只雌性Wistar大鼠随机分为4组：去势组于无菌条件下切除双侧卵巢;微囊移植组手术摘除双侧卵巢后腹腔移植包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊;雌激素替代治疗组手术摘除双侧卵巢后腹腔注射乙烯雌酚 0.2 mg/kg,每3 d注射1次。正常对照组不进行任何处理。 主要观察指标：干预后30 d放射免疫法检测大鼠血清中雌激素水平,观察肾上腺切片的形态学特点,并利用免疫组织化学SP法检测各组大鼠肾上腺皮质各层增殖细胞核抗原表达变化。 结果：①放射免疫法检测正常对照组,雌激素替代治疗组以及微囊移植组雌激素水平明显高于去势组,而正常对照组,微囊移植组,雌激素替代治疗组之间雌激素水平差异无显著性意义。②去势组肾上腺皮质网状带增厚,网状带与球束状带比值增大,束状带和网状带增殖细胞核抗原阳性表达都增加;而微囊移植组及雌激素替代治疗组增殖细胞核抗原阳性细胞明显低于去势组,差异具有显著性意义。 结论：微囊化大鼠卵巢细胞异体移植后,可在受体大鼠体内继续合成和分泌雌二醇,所分泌的雌激素可以纠正肾上腺皮质因卵巢摘除而导致的形态改变,并与雌激素替代治疗疗效相近。     

中波紫外线诱导HaCaT细胞凋亡与扇贝多肽的影响：肿瘤坏死因子α/肿瘤坏死因子受体1通路的研究

背景：扇贝多肽可以通过Fas通路及NF-κB通路发挥对中波紫外线照射后的人角质形成细胞株(HaCaT)的保护作用。 目的：观察中波紫外线辐射后HaCaT细胞的凋亡情况和细胞内肿瘤坏死因子α/肿瘤坏死因子受体1的活化情况,以及扇贝多肽的干预作用。 方法：实验以20 mJ/cm2中波紫外线辐照HaCaT细胞0.5 h建立细胞辐射损伤模型,药物低、中、高剂量组、阳性对照组、抑制剂组分别在造模前2 h加入1.42,2.84,5.69 mmol/L的扇贝多肽、5.68 mmol/L的维生素C及50 mg/L的抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体。 结果与结论：中波紫外线辐照后,HaCaT细胞凋亡增多,肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体1 mRNA及磷酸化JNK蛋白表达量增加;1.42,2.84,5.69 mmol/L的扇贝多肽均可降低中波紫外线辐照引起的细胞内肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体1 mRNA及磷酸化JNK表达,抑制HaCaT细胞凋亡,以5.69 mmol/L扇贝多肽的作用效果最明显,与5.68 mmol/L维生素C的作用相当,且50 mg/L抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体也可明显降低中波紫外线辐照引起的细胞内磷酸化JNK表达。说明扇贝多肽能抑制中波紫外线辐照引起的HaCaT细胞凋亡,其可以通过肿瘤坏死因子α/肿瘤坏死因子受体1通路发挥抗凋亡作用。     

重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对成骨细胞的影响*

背景：人胰岛素样生长因子Ⅰ在成骨细胞中含量丰富,与骨密度有密切关系。 目的：观察重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶合成的影响。 方法：不同质量浓度重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激体外培养的大鼠成骨细胞,噻唑蓝法测定活细胞数量;肿瘤坏死因子α单独或与重组人胰岛素样生长因子Ⅰ共同刺激成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性。 结果与结论：与对照组相比,一定剂量的重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能明显增加大鼠成骨细胞数量(P < 0.05),在质量浓度为0.1~100 μg/L时,成骨细胞数量的增加与质量浓度呈正相关;肿瘤坏死因子α在0.1~100 μg/L范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡(P < 0.05),并使S期细胞减少(P < 0.05),而重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能抑制肿瘤坏死因子α对成骨细胞的促凋亡作用(P < 0.05);与对照组相比,重组人胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的成骨细胞碱性磷酸酶的活性明显增高(P < 0.05)。重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用,且能明显抑制肿瘤坏死因子α诱导的大鼠成骨细胞凋亡,提示增加成骨细胞数量可能是重组人胰岛素样生长因子Ⅰ促进骨形成的机制之一;重组人胰岛素样生长因子Ⅰ能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的合成,提示重组人胰岛素样生长因子Ⅰ有可能促进骨基质的合成和钙化。     

微囊化成年兔许旺细胞的体外培养*

背景：研究发现将体外培养扩增的大量许旺细胞种植到神经导管上来引导周围神经再生效果明显,而目前备受关注的微囊化免疫隔离技术,在克服免疫排斥问题上具有明显的优势与实用性。 目的：微囊包裹兔许旺细胞并进行体外培养,观察许旺细胞形态及增殖变化。 设计、时间及地点：体外细胞水平观察实验,于2005-09/2006-05在南昌大学第二附属医院分子实验室完成。 材料：健康成年家兔由南昌大学医学院动物中心提供,微囊发生器由南昌大学医学院神经生物学研究室研制。 方法：使双侧坐骨神经发生Wallerian变性,经改良后反复差速贴附法进行培养,快速分离纯化许旺细胞。海藻酸钠-氯化钡一步成囊法包裹生长良好的第3代许旺细胞。 主要观察指标：倒置显微镜下观察培养过程中微囊化许旺细胞形态变化,MTT检测不同时期微囊化许旺细胞及游离许旺细胞的增殖改变。 结果：在培养过程中可见微囊及其囊内许旺细胞形态均保持完整,微囊未见破损。微囊化后的许旺细胞总体呈现悬浮生长的趋势。培养0,1,3,5,7 d时 MTT检测微囊许旺细胞组与游离许旺细胞组吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：微囊包裹的许旺细胞体外可存活较长时间,微囊化许旺细胞相比游离许旺细胞增殖速度有所减慢。     

人嗜铬细胞微囊化处理对大鼠异种移植的免疫隔离作用

背景：课题组前期在建立海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹活细胞制备技术的基础上,已证明微囊化嗜铬细胞有良好的镇痛效果,而该微囊包被材料的免疫隔离作用尚需明确。 目的：观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化嗜铬细胞移植到大鼠眼前房和足胝部的免疫排斥反应，评价微囊化技术的免疫隔离作用。 设计：随机对照动物实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室。 材料：选用雌性 SD大鼠48只，鼠龄3个月，由华中科技大学同济医学院实验动物部提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。实验所用海藻酸钠、多聚赖氨酸为美国Sigma公司产品，微囊发生器为德国赠送。 方法：实验于2002-09/2003-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室完成。①取6名脑死亡健康成人的肾上腺髓质，经分离、消化、培养后，制备成人嗜铬细胞悬液。供者家属对实验知情同意，实验方案通过医院伦理委员会批准。采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠法制作空微囊和微囊化细胞。②48只大鼠被随机分为3组：人嗜铬细胞移植组、空微囊移植组、微囊化人嗜铬细胞移植组，每组分眼前房和足胝部两个部位进行移植，每个部位8只。人嗜铬细胞移植组分别将2×1010 L-1细胞悬液注入大鼠右眼前房和左足胝部。空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞组分别吸取空微囊（100个微囊）或ME-HCC（100个微囊，每个微囊包裹400~500个细胞）注入大鼠右眼前房和左足胝部。 主要观察指标：于移植术后第7天采用ELISA法测定血清白细胞介素2水平。采用激光散射比浊仪测定血清IgG和IgM水平。移植术后第28天取大鼠右侧眼球及左侧足组织作常规切片，苏木精-伊红染色，40倍光镜下观察组织形态。 结果：大鼠48只均进入结果分析。①血清白细胞介素2，IgG，IgM水平：空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组均低于人嗜铬细胞移植组，差异有显著性意义（t=8.544~21.64,P < 0.01）。②大鼠眼前房和足胝部组织形态：人嗜铬细胞移植组大鼠的眼前房内和足胝部可见大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润。空微囊移植组和微囊化人嗜铬细胞移植组大鼠眼前房和足胝部仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞。 结论：海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化所产生的良好生物相容性及其机械稳定性，使之有效地发挥了免疫排斥隔离作用。     

小鼠胚胎成纤维细胞成熟化过程中肿瘤坏死因子α的作用

背景：近年的研究表明,肿瘤坏死因子α对不同组织成纤维细胞的作用具有组织特异性及浓度依赖性。 目的：观察肿瘤坏死因子α及其信号传导途径中特异性激酶抑制剂对小鼠胚胎成纤维细胞成熟化所起的作用。 方法：体外培养小鼠胚胎成纤维细胞,将细胞分为3组：第1组用含体积分数2%血清的DMEM高糖培养基培养作为空白对照组;第2组用含100 μg/L肿瘤坏死因子α的培养基培养;第3组先加入质量浓度为50 μg/L的Anti-TNFRSF1B作用1 h后,倒出培养基再加入含有肿瘤坏死因子α的培养基继续培养。采用RT-PCR 法测定各组Ⅰ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶3 mRNA 表达、Western Blot法测定各组Ⅰ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶3蛋白表达。 结果与结论：小鼠胚胎成纤维细胞在一定质量浓度肿瘤坏死因子α作用下,其信号传导途径特异性激酶发生磷酸化或蛋白被激活,信号通路被激活,促进基质金属蛋白酶3的活化,明显降低Ⅰ型胶原的表达。加入其信号传导途径的抑制剂Anti-TNFRSF1B后,肿瘤坏死因子α的效应得到了一定的抑制,但并未完全消除,这更进一步证明肿瘤坏死因子α对小鼠胚胎成纤维细胞活化的作用。     

原代培养人单核细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达与阿托伐他汀的干预

背景：阿托伐他汀作为过氧化酶体增殖体激活受体γ的激动剂,不仅可以调节脂质代谢,而且能够抑制炎症递质生产,减轻缺血性炎症损伤,但其具体作用机制尚不明确。 目的：观察原代培养的人单核细胞中阿托伐他汀对过氧化物酶增殖体激活受体的影响和抗炎作用。 方法：将原代培养的人单核细胞随机分为对照组,10,1,0.1 µmol/L阿托伐他汀组和抗过氧化酶体增殖体激活受体γ抗体组;预先被肿瘤坏死因子α激活的人单核细胞随机分为对照组,0.1,1,10 µmol/L阿托伐他汀组,分别和不同浓度的阿托伐他汀共同孵育24 h,通过电泳迁移率变化分析抗过氧化酶体增殖体激活受体γ蛋白的表达情况,通过酶联免疫吸附实验测定肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1、明胶酶B的水平,并且通过氧电极法测定细胞氧耗量。 结果与结论：在未被肿瘤坏死因子α激活的单核细胞中,阿托伐他汀可以呈浓度依赖性激活抗过氧化酶体增殖体激活受体γ,降低单核细胞趋化蛋白1、降低明胶酶B的水平,但对肿瘤坏死因子α的水平没有明显影响。而在预先被肿瘤坏死因子α激活的单核细胞中,阿托伐他汀使抗过氧化酶体增殖体激活受体γ上调的作用并不明显,但仍可浓度依赖性降低肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1 和明胶酶B的水平,同时阿托伐他汀呈浓度依赖性降低细胞氧耗量达41%。说明阿托伐他汀具有确切的抗炎效果,但这种作用并不完全依赖于过氧化物酶体增殖体激活受体γ途径。