超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞*

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

背景：一些研究者利用超顺磁性氧化铁对骨髓间充质干细胞进行标记,并利用MRI技术对标记细胞肝内、肾内移植后进行初步的活体示踪,但是,对于超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及分化是否有影响研究较少。 目的：观察超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对其存活、增殖以及向神经细胞的分化是否有影响。 方法：使用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞,采用普鲁士蓝染色法鉴定其标记率、锥虫蓝染色法检测细胞活力、MTT法检测标记干细胞的细胞增殖活力、以1 mmol/L β-巯基乙醇及无血清DMEM培养液体外诱导标记细胞向神经细胞分化并用免疫组织化学奠定诱导后细胞、再次使用普鲁士蓝染色法鉴定神经细胞内的铁颗粒。 结果与结论：普鲁士蓝染色对干细胞的标记率接近100%,锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现标记干细胞的增殖活力与未标记干细胞相比差异无显著性意义(P > 0.05);以β-巯基乙醇诱导后大部分骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞、免疫组织化学阳性,再次普鲁士蓝染色显示铁颗粒位于神经细胞的细胞浆内。提示超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及向神经细胞的分化无影响。     

不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像

背景：干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞。 目的：明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量。 设计、时间及地点：对比观察,于2006-09/ 2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成。 材料：猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集;超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供：铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#。 方法：分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105 L-1量组,未标记细胞选取5×105 L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取 5×105 L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析。 主要观察指标：超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率;标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度。 结果：应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2*WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异 (P < 0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上差异无显著性意义(P > 0.05);Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2*WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P < 0.01)。 结论：超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞。     

超顺磁性氧化铁体外标记大鼠骨髓基质干细胞的传代：细胞中铁粒子会随传代而变化吗？*★

背景：超顺磁性氧化铁作为磁共振对比剂已进行了大量临床实验，但其随标记细胞传代分化后的分布及代谢却报道甚少。 目的：实验首次观察和描述了体外超顺磁性氧化铁标记的大鼠骨髓基质干细胞及其传代细胞的情况，并以磁共振信号检测铁粒子随细胞传代的演变情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06/2007-01在川北医学院附属医院医学影像研究所和风湿免疫研究所完成。 材料：清洁级雌性大白鼠2只，由川北医学院动物中心提供。超顺磁性氧化铁由德国先灵公司惠赠。 方法：抽取大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓，采用贴壁法分离纯化骨髓基质干细胞，用铁浓度为42 mg/L的氧化铁-多聚赖氨酸复合物600 μL进行体外标记。 主要观察指标：倒置显微镜下观察各代细胞标记阳性率，磁共振扫描测定磁共振信号强度变化百分率。 结果：普鲁士蓝染色后，镜下第1代细胞超顺磁性氧化铁标记阳性率为100%，随着传代次数的增加，第1~5代细胞标记阳性率逐级降低。与未接受超顺磁性氧化铁标记的PBS对照比较，除第1，2代细胞信号强度变化率无明显变化外，随着细胞的传代磁共振信号强度变化百分率逐渐降低，细胞标记率与T2*WI信号强度呈负性相关(r=-0.986 6，P < 0.005)。 结论：标记入骨髓基质干细胞内的铁能随细胞的传代而传向子代，并可以在一定时期内用磁共振进行追踪检测，实验结果亦首次提出了磁标记的细胞铁粒子可随细胞传代而递减的规律。     

Ferumoxide-PLL标记人骨髓间充质干细胞及其对磁共振成像信号的影响

目的 研究超顺磁性氧化铁Ferumoxide和多聚赖氨酸(PLL)联合标记人骨髓间充质干细胞的可行性及其对体外磁共振成像信号的影响.方法 应用50μg/ml Ferumoxide-PLL标记人骨髓间充质干细胞,普鲁士蓝、台盼蓝染色检测细胞标记率及活细胞率;磁共振扫描仪计数Ferumoxide-PLL标记及未标记细胞数目,计算磁共振成像信号强度变化,经计算机软件拟合曲线计算弛豫时间和弛豫率.结果 Ferumoxide-PLL标记的人骨髓间充质干细胞标记率为96%,活细胞率为97.60%;T2*WI检查显示信号强度平均下降53.45%.经计算机软件拟合曲线,计算得出Ferumoxide-PLL标记的人骨髓间充质干细胞弛豫时间为15.24 ms,未标记细胞为79.88 ms;Ferumoxide-PLL标记细胞的弛豫率为65.61/s,未标记细胞为12.52/s.标记细胞的弛豫率是未标记细胞的5.20倍.结论 Ferumoxide-PLL可以高效标记人骨髓间充质干细胞,显著提高标记细胞的弛豫率,从而提供良好的对比度.     

磁共振活体示踪经冠状动脉骨髓间充质干细胞移植：验证其与病理组织学结果的一致性*☆

背景：目前动物实验及临床研究证明经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞可改善心肌梗死后的心脏功能,但骨髓间充质干细胞经冠状动脉移植后能否到达心肌梗死部位仍存在争议。 目的：磁共振活体示踪经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能否到达心肌梗死部位。 方法：全骨髓法分离培养猪骨髓间充质干细胞,超顺磁性氧化铁标记后胰酶消化,调整细胞浓度为1010 L-1。10只猪均建立心肌梗死模型,造模后1周通过OTW球囊导管经冠状动脉将标记好的骨髓间充质干细胞悬液定向移植至梗死区。普鲁士蓝染色评价细胞标记效率,采用快速梯度回波序列完成长轴位四腔心和二腔心扫描,在以长轴位四腔心和二腔心为定位相,垂直于室间隔获得左心室短轴位图像。 结果与结论：超顺磁性氧化铁可安全有效标记骨髓间充质干细胞,经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能到达心肌梗死区及交界区,磁共振能示踪到超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞,示踪结果与病理组织学检查一致,且磁共振示踪时间可长达5周。     

超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞

背景：目前,超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞在治疗心、肝、肾及中枢神经系统疾病方面已经得到了快速的应用。 目的：对国内外应用超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的现状及新进展作一综述。 方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中2001-12/2009-12关于超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的文章,在标题和摘要中以“超顺磁性氧化铁,干细胞,标记,磁共振成像”或“superparamagnetic iron oxide,stem cells, label, magnetic resonance imaging”为检索词进行检索。选择近5年内文章内容与超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到243篇文献,根据纳入标准选择关于超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞的40篇文献进行综述。 结果与结论：以往通过光镜识别干细胞标记物的研究中,必须用传统的组织病理学检查,从体内取得组织才能进行细胞探测,这显然不适合进行动态观察,更不适用于临床研究。超顺磁性氧化铁可以有效地进行活细胞标记,而这种标记方法不会影响细胞的活力、生长、分裂、迁移、分化等生物学功能,对细胞没有毒性,具有良好的安全性,可以用MRI进行活体示踪研究。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化：超顺磁性氧化铁颗粒的标记

背景：骨髓间充质干细胞体外经多种诱导剂均可成功转化为心肌样细胞,目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮胞苷。超顺磁性氧化铁颗粒直径小,可被干细胞吞噬,加上其顺磁性可被MRI探测到信号,因而成为目前广泛应用于活体检测干细胞移植的理想示踪剂。 目的：与未经标记的干细胞相比,观察超顺磁性氧化铁颗粒标记方式对干细胞体外经5-氮胞苷诱导向心肌样细胞分化效应的影响。 方法：分离培养猪骨髓间充质干细胞,实验组采用P3代细胞经超顺磁性氧化铁颗粒标记,标记后细胞经5-氮胞苷体外诱导24 h后继续培养,对照组直接经5-氮胞苷诱导。2周后用抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白43进行免疫细胞化学染色鉴定,经普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒。 结果与结论：5-氮胞苷诱导分化后细胞表达抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I和连接蛋白43,且超顺磁性氧化铁颗粒标记诱导细胞内普鲁士蓝染色呈阳性。提示超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导后可以分化为心肌样细胞。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子和CM-DiI荧光双标记骨髓间充质干细胞*☆

背景：细胞移植疗效监测取决于有效的标记方法，从而能够对移植细胞进行示踪。超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是一种较为理想的新型磁共振对比剂，用SPIO标记细胞可实现对移植细胞进行活体示踪。而荧光活性染料CM-DiI无细胞毒性，不影响细胞的生长，适合标记和示踪细胞。 目的：观察SPIO及CM-DiI对骨髓间充质干细胞的标记及示踪效果。 方法：全骨髓法培养猪骨髓间充质干细胞，用含50 mg/L铁浓度的SPIO及CM-DiI标记骨髓间充质干细胞，将双标后的骨髓间充质干细胞经冠状动脉注入猪心肌梗死模型。4周后取心脏组织行冰冻切片观察。 结果与结论：SPIO及CM-DiI在体外标记骨髓间充质干细胞效率高，几乎达100%。经冠状动脉移植4周后心肌组织可找到双标记的骨髓间充质干细胞，结果提示SPIO及CM-DiI双标记骨髓间充质干细胞体内示踪效果好。     

人骨髓间质干细胞的体外菲立磁标记

背景：常规干细胞示踪的检测方法,需取实验动物组织进行检查,缺乏示踪的动态检测和无创性。 目的：通过体外菲立磁标记骨髓间质干细胞并进行磁共振成像扫描,明确不同浓度菲立磁对人骨髓间质干细胞细胞活性的影响和检测菲立磁标记的最佳浓度,并筛选出适合人骨髓间质干细胞磁共振成像扫描的成像序列。 方法：使用不同质量浓度菲立磁(100,50,25,12.5 mg/L)与生长状态良好第3代人骨髓间质干细胞孵育24~48 h,另设未进行标记的第3代细胞为空白对照组。两组细胞进行四甲基偶氮唑蓝法检测增殖生长情况并描绘生长曲线。细胞普鲁士蓝染色鉴定人骨髓间质干细胞的标记情况。进行磁共振成像检测,确定最佳磁共振成像序列。 结果与结论：质量浓度≤25 mg/L的菲立磁标记对人骨髓间质干细胞的增殖能力不会产生影响,并且以25 mg/L的标记效果最佳。而≥50 mg/L的菲立磁标记则明显抑制人骨髓间质干细胞的增殖。磁共振成像扫描显示菲立磁标记24,48 h或子代的人骨髓间质干细胞标本T1WI、T2WI以及T2*WI 3个序列上均可见信号降低,以T2*WI变化最为明显。证实菲立磁可用于体外标记人骨髓间质干细胞连续性研究。菲立磁标记对人骨髓间质干细胞增殖能力的影响存在浓度相关性,25 mg/L为最佳标记浓度。磁共振成像T2*WI序列更适合追踪菲立磁标记的人骨髓间质干细胞。