PGN对Aβ1-42寡聚体促进BV2细胞分泌IL-1β的影响

目的探讨前炎介质肽聚糖(peptidoglycan,PGN)激活BV2细胞内吞β淀粉样蛋白(amyloid pro-teinβ,Aβ)1-42寡聚体后,对白细胞介素-1β(IL-1β)分泌的影响及其机制。方法采用细胞株传代法培养BV2细胞替代小胶质细胞,按Klein方法制备Aβ1-42寡聚体。将BV2细胞分为PGN(20μg/mL)组、Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组、PGN(20μg/mL)+Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组,比较BV2细胞分泌IL-1β水平;将BV2细胞予PGN(20μg/mL)及PGN+SB202190,比较两组IL-1β分泌水平;将不同浓度的PGN(0、5、10、20、40μg/mL)加入BV2细胞中培养,分别检测培养液中IL-1β的水平。采用ELISA方法测定BV2细胞培养液中IL-1β的水平。结果 PGN、Aβ1-42寡聚体、PGN+Aβ1-42寡聚体均可激活BV2细胞分泌IL-1β,分泌IL-1β高峰分别为孵育后24h、12h、24h;孵育后6、12、24h同时间相比,PGN+Aβ1-42寡聚体组BV2细胞分泌IL-1β水平均较PGN组和Aβ1-42寡聚体组明显增多(均P<0.05);PGN激活BV2细胞分泌IL-1β的水平与PGN浓度有剂量依赖关系(P<0.05);丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190使BV2细胞分泌IL-1β量明显减少(P<0.01)。结论 PGN可激活BV2细胞分泌IL-1β,且促进Aβ刺激BV2细胞分泌IL-1β增多,p38MAPK抑制剂可抑制IL-1β分泌,推测p38MAPK可能参与BV2细胞分泌IL-1β的过程。     

神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响

目的探讨神经肽Y(NPY)对原代小神经胶质细胞生物活性及生成IL-1β的影响。方法培养的原代大鼠皮层小胶质细胞,将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组,每组3个样本,培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后,显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。Elisa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量,RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βm RNA表达水平。结果孵育各组小胶质细胞6h后,LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及细胞中IL-1βm RNA表达水平分别为(961.00±83.50)pg/m L和5.59±0.87,显著高于Control组的96.33±24.58 pg/m L和1.05±0.12(P0.05),小胶质细胞处于活化状态;LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(411.33±55.00)pg/m L和1.93±0.45,与LPS组相比显著降低(P0.05),小胶质细胞活化水平降低;IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和m RNA表达水平分别为(886.00±97.53)pg/m L和4.51±0.71,与LPS+NPY组相比显著增高(P0.05);LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无统计学意义。NPY组与对照组无统计学意义。结论 NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞的生物活性,抑制其生成IL-1β。     

京尼平对脂多糖诱导小胶质细胞炎症及凋亡的作用及机制研究

目的探讨京尼平(genipin)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞(BV-2)炎症及凋亡反应的作用及机制。方法采用LPS诱导BV-2小胶质细胞建立中枢神经系统炎症和凋亡反应模型。实验细胞分为4组:空白对照组、京尼平组、LPS组、LPS+京尼平组。通过ELISA、RT-PCR、Western Blot、细胞流式检测细胞的炎症及凋亡反应。结果与空白对照组比较,LPS可以诱导BV-2细胞上清培养基中IL-6、IL-1β和TNF-α释放和细胞内IL-6、IL-1β和TNF-α转录的增加;同时,LPS还可以激活凋亡蛋白Bax并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,导致细胞凋亡率的明显升高。京尼平预处理可以有效抑制小胶质细胞介导的炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)激活,并减少LPS诱导的小胶质细胞凋亡。结论 genipin干预可对LPS诱导的小胶质细胞炎症及凋亡反应起到保护作用。     

P2X4/NLRP3炎性小体通路介导小胶质细胞白细胞介素-1β的释放

目的探讨P2X4嘌呤受体和NLRP3炎性小体对炎症反应时小胶质细胞释放白细胞介素-1β(IL-1β)的影响。方法采用脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)双信号干预建立小胶质细胞激活模型,将处于对数生长期生长分化状态良好的小胶质细胞用于实验,按不同干预方法分为8组:正常对照组、ATP组、LPS组、LPS+ATP组、5-BDBD组、ATP+5-BDBD组、LPS+5-BDBD组和LPS+ATP+5-BDBD组。Real time PCR检测各组NLRP3、P2X4 mRNA表达水平;Western blot技术测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)蛋白表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中IL-1β释放水平。结果 2 mmol·L~(-1)ATP能够上调小胶质细胞P2X4 mRNA的表达水平,差异有统计学意义(P0.001);用低浓度(1μg·m L~(-1))LPS初始刺激后,ATP分子能够诱导小胶质细胞中NLRP3 mRNA水平升高(P0.001)、caspase-1蛋白水平表达上调(P0.001)、促进IL-1β释放(P0.01),而P2X4的特异性受体阻断剂5-BDBD抑制上清液中IL-1β水平的上调(P0.05),差异有统计学意义。结论小胶质细胞中IL-1β的释放有赖于P2X4/NLRP3炎性小体途径。     

TLR4-P38MAPK信号通路在LPS诱导BV2细胞中的表达及意义

目的观察LPS诱导小胶质细胞后信号通路Toll样受体4(TLR4)-p38蛋白激酶(p38MAPK)的表达及意义。方法体外培养BV2小胶质细胞,分为对照组、LPS诱导组(LPS刺激12h及24h)及SB203580干预组(LPS+SB203580诱导12h及24h),应用ELISA法检测各组TNF-α、IL-6水平,RT-PCR法检测各组TLR4mRNA和p38MAPK mRNA的表达变化。结果 LPS诱导组细胞分泌TNF-α、IL-6水平显著提高,诱导24h后细胞上清液含量分别为(513.67±14.05)pg/mg和(396.84±15.41)pg/mg。给予SB203580抑制剂后TLR4mRNA和p38MAPK mRNA表达明显减弱,细胞分泌TNF-α、IL-6含量表达与感染组比较也明显降低。结论 LPS刺激小胶质细胞可引起TLR4-p38MAPK信号通路的活化并释放炎性细胞因子,而SB203580则对其有明显的抑制作用,证明TLR4-p38MAPK信号通路与小胶质细胞的炎性活化密切相关。     

STAT3在Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞炎症反应中的作用

目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导小胶质细胞产生炎症反应中信号转导和转录激活子3(STAT3)的表达水平及作用。方法 用蛋白印迹法检测STAT3在Aβ寡聚体诱导的BV2小胶质细胞炎症反应中的表达水平;用siRNA沉默STAT3的表达后,实验分为正常对照组、siRNA STAT3组、Aβ处理组、Control siRNA+Aβ组以及siRNA STAT3+Aβ组,用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL1-β、TNF-αmRNA和蛋白的表达水平。结果 Aβ寡聚体处理小胶质细胞后p-STAT3的表达水平增高,与Aβ寡聚体的浓度和处理时间有关。siRNA沉默STAT3使其mRNA和蛋白表达分别下降约67%和65%;与正常对照组相比,Aβ处理组的IL1-β及TNF-αmRNA和蛋白的表达水平增高;与Aβ处理组相比,siRNA STAT3+Aβ组的IL1-β及TNF-αmRNA和蛋白的表达水平降低。结论 STAT3参与调控Aβ寡聚体诱导的小胶质细胞炎症反应中炎症因子的释放,在阿尔茨海默氏病(AD)的Aβ作用机制中可能有一定的作用。     

Th17/Treg细胞及相关细胞因子在复发缓解型多发性硬化中的作用及机制

目的探讨辅助性T细胞(Th17)、调节性T细胞(Treg)和相关细胞因子在复发缓解型多发性硬化(RRMS)患者发病机制中的作用与机制。方法收集急性期RRMS患者(RRMS组)31例,以神经系统非炎性疾病29例为对照组。RRMS患者入院后给予静脉滴注甲泼尼龙1000 mg/d冲击治疗,后续每3 d剂量减半。对RRMS组患者治疗前和甲泼尼龙治疗2周后(治疗后)分别进行残疾状况拓展性量表(EDSS)评分;采用流式细胞术(FCM)检测RRMS组患者治疗前后及对照组患者外周血Th17(CD4~+IL-17~+)细胞和Treg(CD4~+FOXP3~+)细胞百分率;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RRMS组患者治疗前后及对照组患者外周血血浆中白细胞介素(IL)-17A、IL-23、IL-6、IL-10、IL-35和转化生长因子-β(TGF-β)水平;采用Spearman相关分析对RRMS组患者治疗前外周血Th17细胞数量与IL-17A、IL-23、IL-35、IL-6、IL-10及TGF-β水平进行相关性分析。结果 (1)RRMS组治疗前EDSS评分高于治疗后[分别(6.31±1.54)分vs.(4.02±0.68)分,t=0.75,P0.05];(2)FCM分析结果显示,与对照组[(3.12±1.27)%]比较,RRMS组患者治疗前Th17细胞百分率[(15.24±2.54)%]明显升高(P0.05),而对照组Treg细胞百分率[(35.04±4.21)%]明显高于RRMS组治疗前[(11.12±3.13)%,P0.05];与对照组(0.10±0.02)相比,RRMS组治疗前Th17/Treg(1.51±0.62)也明显升高(P0.01);与RRMS组治疗前[(11.12±3.13)%]比较,甲泼尼龙治疗后Treg细胞比例[(23.14±2.86)%]明显升高(P0.01);与RRMS组治疗前Th17细胞百分率[(15.24±2.54)%]相比,甲泼尼龙治疗后Th17细胞百分率[(4.24±1.14)%]明显降低(t=0.88,P0.05);与RRMS组治疗前(1.51±0.62)相比,甲泼尼龙治疗后Th17/Treg比值(0.19±0.07)降低(t=0.95,P0.01);(3)ELISA法检测结果显示,RRMS组治疗前IL-17A[分别(17.26±1.21)pg/mL vs.(3.23±0.81)pg/mL,t=0.72,P0.05]、IL-23[(分别(64.38±7.51)pg/mL vs.(21.14±1.82)pg/mL,t=0.75,P0.05]、IL-6[分别(70.14±8.17)pg/mL vs.(7.28±0.75)pg/mL,t=0.95,P0.01]和IL-10水平[分别(21.12±2.74)pg/mL vs(2.39±0.34)pg/mL,t=0.91,P0.01]均明显高于对照组,而IL-35[分别(0.31±0.06)pg/mL vs.(1.55±0.16)pg/mL,t=-0.89,P0.01]和TGF-β水平[分别(5.13±0.34)pg vs.(18.25±0.74)pg/mL,t=-0.83,P0.05]显著低于对照组;与RRMS组治疗前比较,治疗后IL-17A[分别(17.26±1.21)pg/mL vs.(4.23±0.90)pg/mL,t=0.82,P0.05]、IL-23[分别(64.38±7.51)pg/mL vs.(29.73±2.51)pg/mL,t=0.77,P0.05]和IL-6[分别(70.14±8.17)vs.(15.23±1.86),t=0.89,P0.01]水平明显降低,IL-35(分别(0.31±0.06)pg vs.(1.41±0.18)pg,t=-0.88,P0.01)和TGF-β水平[分别(5.13±0.34)pg vs.(16.91±0.59)pg,t=-0.72,P0.05]明显升高;(4)RRMS组患者Th17细胞与IL-17A(r=0.89,P0.01)、IL-23(r=0.71,P0.05)和IL-6(r=0.83,P0.05)水平呈正相关,与IL-35和TGF-β水平呈负相关[分别r=-0.82,P0.01;r=-0.74,P0.05]。结论 RRMS的发生可能与Th17细胞上调,Treg细胞下调,Th17/Treg表达失衡,相关细胞因子IL-17A、 IL-23、IL-6水平升高,IL-35和TGF-β水平降低有着密切关系。     

芍药苷对Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响

目的探讨芍药苷(PF)对β-淀粉样蛋白(Aβ)_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响。方法原代培养大鼠小胶质细胞,分别用0、5、25、50μmol/LPF预处理细胞后,采用CCK-8法和LDH法检测细胞毒性。将培养的细胞分为空白对照组(正常培养基)、阳性对照组(Aβ_(1-42)处理细胞)和实验组(PF+Aβ_(1-42)处理细胞)。采用ELISA法检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和趋化因子配体1(CXCL1)、趋化因子配体2(CCL2)的表达水平。采用Transwell小室进行小胶质细胞体外趋化实验,观察各组细胞趋化迁移情况。结论培养大鼠原代小胶质细胞纯度达90%以上,CCK-8法和LDH法测定均显示PF对小胶质细胞无明显细胞毒作用(均P0.05)。PF可抑制Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞分泌促炎性介质TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子CXCL1、CCL2(均P0.01)。同时,PF可抑制小胶质细胞向Aβ_(1-42)的趋化(均P0.05)。结论 PF可抑制Aβ_(1-42)诱导的啮齿动物小胶质细胞生成促炎性介质和趋化因子,并抑制小胶质细胞向Aβ_(1-42)趋化迁移,提示PF可能为阿尔茨海默病的治疗提供新的契机。     

尼古丁上调星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

目的研究尼古丁激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nicotinic receptors,7 n AChRs)上调内源性B-晶状体蛋白(αB-crystallin,Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(Amyloid,Aβ)集聚的现象及其机制。方法分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定;体外制备Aβ_(1-42)寡聚体;将细胞分为对照组、尼古丁组、α7n AChRs阻断剂(methyllycaconitine,MLA)组、Aβ_(1-42)组、尼古丁+Aβ_(1-42)组、PI3K信号通路阻断剂LY294002+尼古丁+Aβ_(1-42)组。用蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞内Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚体的表达水平。结果尼古丁可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白(P0.05);尼古丁能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平(P0.05);在细胞裂解液及培养基中,尼古丁显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用(P0.01)。结论尼古丁通过激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚;PI3K/Akt信号通路可能参与尼古丁激活星形胶质细胞α7 n AChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。为进一步研究尼古丁抑制Aβ集聚的可能机制提供了实验基础。     

硫化氢通过JAK2/STAT3通路抑制脂多糖诱导的小胶质细胞M1型极化

目的观察硫化氢(H_2S)对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞极化的影响并探讨JAK2/STAT3信号通路是否介导其作用。方法将培养的N9小胶质细胞随机分为对照组、LPS组、硫氢化钠(NaHS)组、LPS+NaHS组、蛋白酪氨酸激酶(JAK2)/信号转导和转录激活因子(STAT3)抑制剂α-氰基-(3,4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG-490)组、LPS+NaHS+AG-490组共6组,每组设3个复孔。采用MTT法检测各组细胞活力,采用ELISA法检测各组胶质细胞及培养上清液中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-4 IL-10水平,采用Western-blot检测各组细胞精氨酸酶1(Arg1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、磷酸化JAK2(p-JAK2)和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达。结果与对照组比较,LPS组细胞Arg1蛋白及IL-4和IL-10表达水平增加,而iNOS蛋白、IL-1β、IL-6、p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表达降低,p-JAK2/t-JAK和p-STAT3/t-STAT3比值降低(均P0.05)。与LPS组比较,LPS+NaHS组细胞Arg1蛋白及IL-4和IL-10表达水平增加,而iNOS蛋白、IL-1β、IL-6、p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表达降低,p-JAK2/t-JAK2和p-STAT3/t-STAT3比值降低(均P0.05)。JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG-490可减弱NaHS的作用。结论 H_2S可抑制LPS诱导的小胶质细胞M1型极化,其机制可能是通过JAK2/STAT3信号通路实现。     

选择性5-羟色胺再摄取抑制剂对小胶质细胞不同活化途径的影响

目的 探讨SSRIs氟西汀和艾司西酞普兰对于小胶质细胞不同活化途径的影响.方法 新生2 dSD大鼠脑组织经洗涤、分离、消化、过筛网、离心等处理,获得原代小胶质细胞.将BV2细胞系组和原代细胞组进一步分亚组如下:空白对照组、M1型模型组、M2型模型组、氟西汀组和艾司西酞普兰组,干预24h后使用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹法测定相关炎症指标表达水平.结果 (1)M1型活化:RT-PCR示氟西汀可显著降低脂多糖联合干扰素-γ(LPS+INF-γ)诱导的BV2细胞白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor,TNF-a)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达(均P＜0.05).氟西汀和艾司西酞普兰均可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞IL-6(均P＜0.01)、TNF-a(P =0.018、0.029)和iNOS(均P=0.005)mRNA表达.免疫印迹法示氟西汀和艾司西酞普兰可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的BV2细胞Iba-1 (P ＜0.01、P=0.002)、CD86(均P＜0.01)蛋白表达.氟西汀和艾司西酞普兰均可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞CD86表达(均P＜0.01).ELISA示氟西汀可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的BV2细胞TNF-a(P=0.003)和IL-1 β(P=0.002)分泌.氟西汀和艾司西酞普兰可显著抑制LPS+ INF-γ诱导的原代小胶质细胞IL-1β分泌(均P＜0.01).原代小胶质细胞各组间TNF-a分泌差异无统计学意义(F=4.627,P=0.053),进一步组间比较示与模型组[(11.6±1.1)g/L]相比,艾司西酞普兰组[(20.2±1.9) g/L]TNF-a表达增高(P=0.012).(2)M2型活化:RT-PCR示氟西汀可显著提高IL-4诱导的原代小胶质细胞IL-10 mRNA表达(P=0.036).免疫印迹法示氟西汀可显著提高IL-4诱导的BV2细胞(P=0.016)和原代小胶质细胞(P＜0.01)CD206表达.ELISA示氟西汀可显著提高IL-4诱导的BV2细胞(P=0.044)和原代小胶质细胞(P＜0.01)IL-10分泌.结论 氟西汀和艾司西酞普兰可通过影响小胶质细胞活化状态而发挥免疫调节作用,这可能是SSRI类抗抑郁剂发挥抗抑郁作用机制之一.     

沉默信息调节因子1抑制核因子κB通路调控癫痫大鼠小胶质细胞活化的机制研究

目的探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)在癫痫中对小胶质细胞及炎症因子的影响及作用机制.方法建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型,免疫组化观察各组(对照组和癫痫组)大鼠脑组织内小胶质细胞活化;采用脂多糖(LPS)建立小胶质细胞活化模型,构建pcDNA-SIRT1和si-SIRT1载体,转染至大鼠小胶质细胞中.定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)测定大鼠海马组织及小胶质细胞中SIRT1表达,Western blot检测小胶质细胞的活化标志物Iba1和核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白(p65和IκBα)的蛋白表达水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测促炎因子[白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)]的表达水平.结果与Control组比较,癫痫大鼠海马组织中SIRT1 mRNA表达量显著降低(P<0.05),Iba1蛋白表达量显著增加(P<0.05),且对照组CA1、CA2区Iba1阳性细胞数分别为(180±21)、(190±18)/mm2,癫痫组CA1、CA2区Iba1阳性细胞数分别为(412±35)、(470±37)/mm2,两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05).同样,与Mock组比较,LPS活化小胶质细胞中SIRT1表达水平显著降低,Iba1蛋白表达水平显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05).转染pcDNA-SIRT1及si-SIRT1至LPS活化的小胶质细胞中,LPS+pcDNA-SIRT1组IL-1β[(50.0±3.3)ng/L]、IL-6[(55.0±3.2)ng/L]和TNF-α[(56.1±3.0)ng/L]表达水平显著低于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05);LPS+si-SIRT1组中IL-1β[(98.2±4.3)ng/L]、IL-6[(108.1±4.5)ng/L]和TNF-α[(124.5±4.1)ng/L]表达水平显著高于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05);同时LPS+pcDNA-SIRT1组NF-κB p65的表达水平显著低于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05),IκBα的表达水平显著高于LPS组和LPS+pcDNA-NC组(均P<0.05);而LPS+si-SIRT1组NF-κB p65的蛋白表达水平显著高于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05),IκBα的表达水平显著低于LPS组和LPS+si-NC组(均P<0.05).加入NF-κB通路激活剂Aconine后,与LPS+pcDNA-SIRT1组比较,LPS+pcDNA-SIRT1+Aconine组大鼠中Iba1表达水平显著升高(P<0.05);LPS+pcDNA-SIRT1+Aconine组大鼠中IL-1β[(72.2±4.3)ng/L]、IL-6[(80.1±4.0)ng/L]和TNF-α[(87.2±4.5)ng/L]表达水平显著高于LPS+pcDNA-SIRT1组的[(50.1±2.3)]ng/L、[(55.0±3.4)]ng/L和[(56.3±4.9)ng/L](均P<0.05).结论SIRT1可能通过抑制NF-κB通路活性来抑制癫痫大鼠小胶质细胞的作用.     

胚胎神经干细胞对巨噬细胞分泌炎性反应因子的影响

目的探讨小鼠胚胎皮质来源的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性因子和一氧化氮(nitric oxide,NO)表达的影响。方法体外分离、培养NSCs与巨噬细胞。实验分组为NSCs组、小鼠骨髓来源巨噬细胞组(简称为巨噬细胞组)、小鼠骨髓来源巨噬细胞+NSCs非接触型共培养组(简称为非接触型共培养组)和小鼠骨髓来源巨噬细胞+NSCs接触型共培养组(简称为接触型共培养组)。培养24h后添加10ng/mL干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)再孵育24h后收集各组上清液,利用ELISA检测上清液炎性反应因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达,采用Griess法测量NO的表达水平。结果成功体外分离、培养原代NSCs和巨噬细胞。与巨噬细胞组相比,非接触型共培养组和接触型共培养组巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-1β明显下降,而IL-10明显增加(均P0.01)。与非接触型共培养组比较,接触型共培养组TNF-α降低〔(65.68±7.15)pg/mL比(90.99±5.57)pg/mL〕,IL-10升高〔(531.38±60.11)pg/mL比(324.32±45.41)pg/mL〕(均P0.01),而IL-1β和NO表达无统计学差异(P0.05)。结论 NSCs能够明显降低活化巨噬细胞NO和促炎性因子TNF-α、IL-1β的释放,增加抗炎性因子IL-10的分泌,减轻炎性反应程度,其机制可能主要通过NSCs分泌可溶性因子起作用。     

MBP刺激下小鼠DC的定向分化对Th细胞亚型的诱导

目的 探讨不同亚群树突状细胞(DC)对初始型T辅助细胞(ThO)分化的影响.方法 分离实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)易感性BALB/c小鼠脾脏的DC前体细胞,与髓鞘碱性蛋白(MBP)及重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)、IL-3共培养,然后取上述培养的DC与单个核细胞(mononuclear cell,MC)培养,测定培养液上清液中干扰素-γ(IFN-γ)和IL-4水平.结果 DC与MC共培养经IL-4刺激后其上清液中IFN-γ水平[(23.8561±3.2675)pg/mL]较IL-3刺激组[(20.8422±3.5225)pg/mL]及对照组[(20.2845±3.1043)pg/mL]明显增高(P＜0.05);经IL-3刺激后其上清液中IL-4水平[(10.9457±1.9180)pg/mL]较IL-4刺激组[(9.1826±1.5361)pg/mL]及对照组[(9.2046±1.3261)pg/mL]明显增高(P(0.05).结论 不同亚群DC对ThO细胞分化的影响不同,提示可通过调控DC的分化方向调控ThO细胞的分化.     

布美他尼对LPS诱导的小胶质细胞活化及炎性分泌的影响

目的观察钠-钾-氯共转运体(Na+-K+-2Cl-cotransporter 1,NKCC1)的特异性抑制剂布美他尼(Bumetanide)对LPS(脂多糖)诱导的小胶质细胞活化及炎性因子分泌的影响。方法差速贴壁法培养大鼠原代小胶质细胞,纯化的小胶质细胞分为对照组,LPS组(1.0μg/ml)和布美他尼干预组(NKCC1抑制剂,10μM),在干预1、3、6和12 h固定细胞爬片,免疫荧光双标显示小胶质细胞活化形态;各时间点收取上层培养基,用ELISA法测定各组培养基中TNF-α和IL-1β的水平。结果 LPS干预后小胶质细胞活化,体积增大,布美他尼干预后小胶质细胞活化受到抑制。小胶质细胞分泌的TNF-α和IL-1β在LPS干预1 h时开始明显增加,TNF-α的分泌在6 h达到最高峰;IL-1β的分泌在3 h时达到最高峰(P0.05)。布美他尼干预后与LPS组比较,TNF-α和IL-1β分泌明显减少,其中在3、6、12 h时TNF-α分泌显著降低(P0.05),而IL-1β的分泌在1、3、6、12 h时明显降低(P0.05)。结论布美他尼可减少LPS诱导的小胶质细胞活化及炎性因子分泌增加,提示NKCC1通路在小胶质细胞活化及炎性因子分泌中发挥了重要作用。     

补体C3d-p28对阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫增强作用

目的探讨补体C3d-p28作为分子佐剂,在阿尔茨海默病DNA疫苗基因免疫中的作用。方法在第1、8、22、43、64、85、106、127天,将重组质粒p(Aβ3-10)10、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)肌肉注射于APP/PS1双转基因鼠后腿股四头肌内。疫苗接种前、自第2次注射开始每次接种后7天取鼠眶静脉血共8次,以ELISA法检测抗Aβ抗体的滴度和分型;第8次(最后1次)眶静脉取血后进行6d的Morris水迷宫实验,通过定位航行和空间探索实验评估小鼠空间学习记忆能力。水迷宫实验结束后处死小鼠,以ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)水平,免疫组化染色法检测小鼠脑内Aβ斑的表达。结果 p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗Aβ抗体水平高于p(Aβ3-10)10组[(55.03±8.93)μg/mLvs.(27.32±7.69)μg/mL,t=-4.455,P0.05],p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3组抗体类型主要是IgG1型[(50.64±6.96)μg/mL],明显高于p(Aβ3-10)10组[(14.15±3.16)μg/mL,P0.05]。与p(Aβ3-10)10组比较,p(Aβ3-10)10-C3dp28.3组Morris水迷宫实验平均逃避潜伏期变短、穿越平台次数和穿越平台所在象限停留的时间比例明显增多(均P0.05);脾细胞培养上清液中IL-4水平增高[(110.22±18.12)pg/mL vs.(170.12±22.16)pg/mL,P0.05]、IFN-γ水平减低[(800.12±80.11)pg/mL vs.(640.12±70.53)pg/mL,F=6.152,P0.05];脑内沉积的Aβ斑块明显减少(P0.05)。结论补体C3d-p28分子佐剂使p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3抗Aβ抗体的产生增加、Th2型免疫反应增强,转基因鼠空间学习记忆能力提高。     

骨髓间充质干细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的Iba1、IL-1β和IL-10影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的小胶质细胞Iba1、IL-1β和IL-10表达的影响。方法以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(MOG 35-55)免疫诱导C57BL/6雌性小鼠制备EAE小鼠模型。将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组:BMMSCs移植组、EAE组和正常组。采用免疫组化检测脑和脊髓的Iba1(离子钙结合衔接分子1)、IL-1β和IL-10的表达。结果 BMMSCs移植组神经功能缺损症状要轻于EAE组,BMMSCs移植组脑和脊髓的Iba1和IL-1β表达水平低于EAE组(P0.05),而BMMSCs移植组脑和脊髓的IL-10表达水平高于EAE组(P0.05)。结论 BMMSCs能改善EAE小鼠的症状,其作用机制之一可能是抑制了小胶质细胞的激活、抑制炎症因子IL-1β及促进抗炎因子IL-10的表达。     

Notch通路对缺氧诱导N9小胶质细胞释放炎症因子的调节作用

目的 应用γ-分泌酶抑制剂(DAPT)抑制Notch信号通路活化,探讨Notch信号通路在缺氧诱导小胶质细胞释放炎症因子中的作用. 方法 将体外培养的N9小胶质细胞分4组:常氧组、缺氧组、常氧+ DAPT组和缺氧+DAPT组.常氧+DAPT组与缺氧+DAPT加入10 μmol/LDAPT处理12h,常氧组和缺氧组加入等量溶剂,缺氧组、缺氧+10 μmol/L DAPT组同时进行缺氧处理12 h (3％O2).提取各组细胞mRNA及蛋白,实时定量PCR检测各组细胞白介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA水平,Western blotting检测Notch信号通路中Notch1胞内段(N1ICD)、Hes1、Hey1蛋白水平,并运用ELISA法检测各组细胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌水平. 结果 DAPT对炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白分泌具有抑制作用,并随着浓度的增加,抑制作用增大.分组处理12h后,缺氧组炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白分泌水平较常氧组明显升高,Notch通路信号分子N1ICD、Hes1、Hey1水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与缺氧组比较,缺氧+DAPT组炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白分泌水平降低,Notch通路信号分子N1ICD、Hes1、Hey1水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05);常氧+DAPT组与常氧组比较,上述指标差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 Notch信号通路参与调控缺氧诱导的小胶质细胞炎症介质的释放.     

阿托伐他汀对β淀粉样蛋白1-42诱导阿尔茨海默病大鼠模型的抗炎作用

目的 探讨阿托伐他汀对β淀粉样蛋白1-42(β-amyloid 1-42,Aβ1-42)诱导阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠模型学习记忆功能及脑内炎性因子的分泌、神经细胞损伤的影响.方法 将60只Wistar大鼠(体重300～350 g)完全随机分为对照组、模型组、他汀对照组和治疗组,每组各15只.服用阿托伐他汀(每天5 mg/kg)3周为治疗组,采用侧脑室注射Aβ1-42的方法制备大鼠痴呆模型,设假手术组为对照组.水迷宫实验观测大鼠的行为学变化,免疫组织化学方法测定海马区炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,HE染色观察海马区形态结构的变化,透射电镜观察海马区神经元和小胶质细胞超微结构的变化.结果 模型组大鼠的学习记忆成绩下降(逃避潜伏期:对照组12.0±1.2,模型组41.3±3.4,t=18.0363,P<0.01),海马区炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌增多(IL-1β:对照组53.5±2.4,模型组101.0±3.8,t=23.8246,P<0.01);阿托伐他汀治疗组与模型组大鼠相比较,学习和记忆成绩有所改善(逃避潜伏期:25.7±1.6,41.3±3.4,t=9.1076,P<0.01),海马区IL-1β、IL-6、TNF-α分泌减少(IL-1β:60.0±3.4,101.0±3.8,t=18.0231,P<0.01).细胞形态学观察显示,与模型组相比,阿托伐他汀治疗组模型海马区神经细胞损伤减轻,胶质细胞增生减少.结论 阿托伐他汀可以减少大鼠AD模型海马区胶质细胞炎性因子的分泌,减轻神经细胞损伤,改善其学习和记忆能力.