不同传代倍数人羊膜来源的间充质干细胞成骨成脂分化平衡的研究

目的比较不同传代倍数的人羊膜来源的间充质干细胞（hAMSCs）的增殖活性以及成骨、成脂的分化能力。方法采用胶原酶和胰蛋白酶法分离人胎盘羊膜来源的MSCs,测定分离细胞的表面分子标志。对第3、5、7、9代hAMSCs绘制细胞生长曲线,分别加入成骨和成脂诱导剂,诱导3W后行茜素红和油红O染色,比较不同传代倍数的hAMSCs成骨染色阳性率和成脂率。结果hAMSCs传代至第9代时仍呈克隆样生长,但细胞增殖活力有下降;在第5代后成骨分化能力下降（P〈0．01）,而传代至第7代后,成脂分化能力才有下降（P〈0．01）。结论hAMSCs在连续传代中能保持MSCs的生长特性,但多向诱导分化能力在不同的传代倍数中有一定差别。     

前成脂细胞及其临床应用潜能研究进展

脂肪组织与营养平衡和代谢性疾病密切相关,其中脂肪细胞的分化方式将直接影响脂肪组织的健康.前成脂细胞,是脂肪组织中一群能且仅能向成熟脂肪细胞分化的细胞,因其良好的成脂潜能,在再生医学和肥胖相关疾病的治疗中起着重要作用.本综述根据近年来前成脂细胞的相关研究成果,对前成脂细胞定义的不确定性进行了讨论,初步探讨了前成脂细胞的起...     

人转化生长因子β_2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞和基因增强的组织工程的可行性。方法:取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,通过脂质体介导,将hTGFβ2基因转染到体外培养的脂肪间充质干细胞中,采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。结果:从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴向脂肪细胞分化;hTGFβ2基因转入脂肪间充质干细胞能获得瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成。结论:从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,可自发或经诱导后分化为脂肪细胞;pcDNA3.1(+)/hTGFβ2真核表达载体成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

DNA甲基化调节间充质干细胞成骨分化调控创伤相关骨病的研究进展

间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力与多向分化潜能的干细胞,是目前骨组织工程主要的细胞来源,可用于多种骨骼疾病的治疗。DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,可以通过调控成骨特异性基因的表达影响MSCs的成骨分化,进而影响骨质疏松、骨坏死等创伤相关骨病的发生、发展。笔者从DNA甲基化的概述、DNA甲基化调控MS...     

人神经干细胞在宿主鼠脑内分化成神经元呈脑位点特征

目的研究人胎脑神经干细胞植入年幼大鼠脑后的成神经元分化作用,探讨神经干细胞替代治疗小儿脑病的可行性。方法自孕16周的胎脑组织分离培养出神经干细胞球,在小儿脑脊液中培养诱导分化以证明其分化潜能。将培养14d的神经干细胞球移植10d龄鼠的侧脑室内,于移植后第4、7、14天杀鼠取脑,切片,行人神经丝特异性标志的免疫荧光分析,显示神经元的分布和细胞形态。结果培养获得典型神经干细胞球,呈漂浮生长,在小儿脑脊液中能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。用抗人神经丝混合单抗检测移植物的成神经元分化,移植后的第4天,观察到阳性反应细胞在颗粒层表现为颗粒性细胞,锥体细胞层则出现长突起的锥体细胞,还有连接神经元样中间神经元,小脑内有单层排列的浦肯野细胞。对比各时间点的观察结果,阳性细胞分布位置未变。随着移植后天数的后延,阳性细胞数量呈减少趋势,但锥体细胞的突起明显加长。结论体外培养获得的人神经干细胞脑室途径移植年幼大鼠,在脑内发生迁移,并分化成形态上与其临近宿主细胞一致的神经元。提示宿主脑组织局部微环境在引导移植物分化成神经元中发挥了重要作用。     

尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞生物学特性影响的实验研究

目的:探讨体外尼古丁对大鼠髌腱肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的细胞活力、细胞早期凋亡以及肌腱相关基因表达的影响,揭示吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制。方法:无菌条件下取8周龄SD大鼠的髌腱,I型胶原酶消化分离获得单个有核细胞,以最适密度(50个/cm2)进行接种,细胞呈克隆样生长,获得原代TDSCs。基础培养细胞至第3代,将其分为两组,实验组用不同浓度的尼古丁培养基(10-7 M,10-6 M,10-5 M,10-4 M和10-2 M)干预,对照组继续采用基础培养基(0M)培养。处理6 h、24 h、48 h和72 h后分别应用四唑盐(MTT)比色法检测尼古丁对TDSCs体外存活的影响,72h后应用Annexin V-FITC/PI双染法检测尼古丁对TDSCs体外早期凋亡的影响,实时荧光定量PCR(Realtime PCR)检测肌腱相关基因Col1a1和Scx的表达。结果:与对照组相比,实验组不同浓度的尼古丁干预下,TDSCs的细胞活力呈下降趋势,呈时间依赖性和浓度依赖性,浓度高于10-4 M时作用显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测TDSCs早期凋亡(Annexin V+/PI-)的数量随着尼古丁浓度的增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,Realtime PCR检测结果显示:与对照组相比,实验组中Col1a1和Scx的m RNA表达水平均降低,浓度高于10-5 M时作用显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:体外尼古丁可抑制大鼠髌腱TDSCs的细胞活力,导致TDSCs早期凋亡,同时抑制TDSCs中成肌腱分化转录、细胞外基质合成相关基因的表达。这可能是吸烟导致肌腱病变以及损伤肌腱延迟愈合的潜在细胞学发病机制。     

鸢尾素对炎症状态下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究鸢尾素(irisin)对炎症状态下骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的保护作用。方法 分离、培养小鼠BMSCs并将其分为3组：对照组(Vehicle),牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导炎症组(LPS),Irisin干预组(LPS+irisin; Irisin)。CCK-8试剂盒检测细胞活力；成骨诱导培养后检测碱性磷酸酶(ALP)活性，qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osx)、ALP和骨钙素(OCN)的转录表达，Western blot检测成骨相关蛋白ALP和OCN的表达，茜素红染色半定量分析检测矿化水平。结果 与Vehicle组相比，LPS显著促进BMSCs增殖(P<0.05);LPS下调Runx2、Osx、ALP和OCN的转录水平，降低ALP和OCN蛋白表达(P<0.05),而irisin干预显著上调Runx2、Osx和ALP转录表达，提高ALP和OCN蛋白表达，并提高矿化水平(P<0.05)。结论 Irisin可促进炎症微环境中小鼠BMSCs成骨分化。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMSCs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEC2处理细胞,检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测骨桥蛋白和胶原蛋白的基因表达。结果 rBMSCs在应用SEC2诱导时,随着浓度的增加,rBMSCs的增殖逐渐被抑制,其中100μM SEC2共培养细胞增殖情况明显高于对照组(P<0.01);应用100μM SEC2诱导rBMSCs 16d后,成骨诱导检测茜素红染色可见矿化和钙沉积;同时进行RT-PCR检测,随着培养时间的延长,骨桥蛋白(Osteopontin)和胶原蛋白-1(Collagen I)有明显上调趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SEC2能够使rBMSCs成骨分化,分化的效果与肠毒素剂量及诱导时间相关。     

牙髓干细胞的研究进展

干细胞被定义为具有自我更新高度增殖和多向分化能力的细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于伦理问题在很多国家被禁止研究,而成体干细胞的研究正受到越来越多的关注。1999年,《SCIENCE》杂志将有关干细胞的研究成果评定为世界十大科学进展榜首。干细胞可在多种组织中获得。目前,人类对骨髓间充质干细胞的研究较为成熟,其临床应用也取得一定成功,牙髓干细胞（Dental pulp stem cells,DPSCs）虽然还未在临床应用,但它已经成为全球口腔医学研究的热点之一。     

运动对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧生成的影响及调控机制

目的:观察耐力运动训练对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧(ROS)生成的影响,并探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)对ROS生成调控的潜在机制。方法:C57BL/6小鼠分为青年对照组(YN组,2月龄,12只)、老年对照组(ON组,12月龄,12只)和老年运动训练组(OT组,12月龄,12只),其中OT组进行中等强度跑台训练(0°,17 m/min,25 min/天,5天/周)。12周后,HE染色鉴定骨骼肌萎缩程度。两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,原代培养并体外诱导成肌分化24 h。倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度,测定线粒体呼吸功能、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率、肌球蛋白重链(MyHC)各亚基mRNA表达,及MyHC、PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达量。结果:与YN组比较,ON组肌纤维横截面积、肌管形成数量、My-HC蛋白表达、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表达、态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)和PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达均显著降低(P<0.05～0.01),ON组态4呼吸速率(ST4)、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著升高(P<0.05～0.01)。与ON组比较,OT组湿重/体重比值、肌纤维横截面积、肌管形成数量、MyHC蛋白表达、MyHCⅠ、MyHCⅡa、My-HCⅡx mRNA表达、ST3、RCR和PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达均显著升高(P<0.05～0.01),OT组细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著降低(P<0.05～0.01)。结论:耐力运动训练提高衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中PGC-1α表达,继而通过上调Tfam和MnSOD提高线粒体能量代谢,减少线粒体ROS产生,以促进成肌分化。     

过表达miR-378a修饰骨髓间充质干细胞复合胶原蛋白海绵支架对大鼠股骨缺损的修复作用

目的 探究过表达miR-378a修饰骨髓间充质干细胞(BMMSCs)复合胶原蛋白海绵(CS)支架修复大鼠股骨缺损的效果。方法 分离培养BMMSCs并采用流式细胞术鉴定细胞表型。使用过表达miR-378a的慢病毒及阴性空载慢病毒转染BMMSCs，将转染细胞分为3组：过表达miR-378a转染BMMSCs组(LV-miR-378a组)、阴性对照慢病毒转染BMMSCs组(LV-miR-NC组)、未转染BMMSCs组(对照组)，并采用流式细胞术检测转染效率。制备转染细胞与CS支架的复合物，使用扫描电镜观察细胞与支架的相容性。建立SD大鼠股骨缺损回植模型，将15只SD大鼠随机分为3组(n=5):LV-miR-378a+CS组(植入过表达miR-378a慢病毒的BMMSCs复合CS支架)、LV-miR-NC+CS组(植入阴性空载慢病毒转染的BMMSCs复合CS支架)、CS组(只植入CS支架)。术后第8周，使用CO2吸入法处死SD大鼠，取手术侧股骨样本进行大体观察、微型CT扫描重建，定量分析骨密度(BMD)及骨体积分数(BV/TV)，并采用HE、Masson及骨桥蛋白(OPN)免疫组化染色观察骨修复...     

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与创伤愈合

创伤愈合是一复杂生物学过程，通常认为是由进入伤口的成纤维细胞增殖、分化和合成分泌，细胞外基质的纤维化，新生血管长入伤口的血管化和表皮细胞增生覆盖创面的再上皮化等综合作用的结果，而在愈合过程中产生的生长因子，包括bFGF，大多对皮肤伤口的纤维化、血管和再上皮化有介导和调控作用，可促进愈合。现将bFGF与创伤愈合的关系简要介绍如下：     

骨髓脂肪在骨质代谢中的作用及其相关机制

随着人的年龄增长,骨髓组织会发生一系列骨生物学和病理生理学的代谢变化,间充质干细胞的成骨/成脂化过程构成骨质代谢的主要部分,骨髓组织为间充质干细胞和造血干细胞的分化成熟提供独特的生长环境。骨髓脂肪细胞异常增多是导致骨质疏松等疾病的重要因素之一,诸多细胞因子、激素分子通过复杂的信号通路网络作用于这个过程。就骨髓脂肪在骨质代谢中发挥的作用及其可能的发生机制予以综述。     

模拟微重力条件下成骨生长肽促进MC3T3-E1成骨样细胞的增殖与分化

目的研究回转模拟微重力(simulated microgravity,SMG)条件下成骨生长肽(OGP10-14)对MC3T3-E1成骨样细胞增殖与分化的影响。方法利用回转器模拟失重,MTT法检测OGP10-14对回转24 h,48h,72 h MC3T3-E1细胞增殖的效应,并观察培养液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥素(osteopontin,OPN)活性变化。结果回转模拟微重力条件下,10-8mol/L OGP10-14能够显著促进成骨细胞系MC3T3-E1的增殖(P<0.01)并促进成骨细胞系MC3T3-E1的ALP和OPN活性。结论回转模拟微重力条件下,OGP10-14对成骨细胞系MC3T3-E1的增殖与分化具有促进作用。     

血管内皮祖细胞对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞脂肪化的影响

 目的 探讨血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)对骨质疏松(OP)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)自主脂肪化的影响。方法 选6周龄雌性 SD 大鼠,建立OP模型。体外分离、培养大鼠EPC、BMSC。分别取第3、6代BMSC及原代EPC,建立EPC/BMSC 间接共培养体系。实验分组:假手术组BMSC(BMSC sham)、OP组BMSC(BMSC ovx)、OP BMSC /EPC共培养组(BMSC ovx/EPC);MTT法检测细胞增殖情况;油红 O染色检测成脂分化情况,real- time PCR检测成脂分化标志物PPARγ2的mRNA表达水平。结果 BMSC ovx/EPC 组BMSC的增殖能力显著高于BMSC ovx组;BMSC ovx/EPC组自主脂肪细胞分化水平明显低于BMSC ovx组。结论 EPC可通过间接接触提高骨质疏松大鼠BMSC的增殖能力,并能有效抑制OP大鼠BMSC的自主脂肪化。     

碱性成纤维细胞生长因子对表皮细胞中端粒酶反转录酶表达的影响

目的观察表皮细胞去分化过程中人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达差异及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响。方法采用bFGF诱导表皮细胞去分化形成表皮前体干细胞,免疫细胞化学染色法检测bFGF诱导培养后表皮细胞表型的改变,并用流式细胞法、免疫荧光染色及TRAP-银染法检测bFGF诱导培养后表皮细胞中hTERT的表达差异。以同等条件下未经bF-GF处理的人表皮细胞为对照组,同期分离培养的人在体表皮干细胞为阳性对照组。结果免疫细胞化学染色显示,bFGF诱导培养后表皮细胞中β1-integrin、CK19、CK14表达明显增强,而CK10表达明显降低。流式细胞仪检测显示,bFGF诱导后实验组、对照组及阳性对照组hTERT阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的98.41%、0.77%及99.76%。TRAP-银染法检测显示实验组hTERT表达活性明显上调,且与阳性对照组比较无显著差异。间接免疫荧光染色显示实验组去分化来源表皮干细胞和在体表皮干细胞中的hTERT分布存在着亚细胞位点差异。结论 bFGF可诱导表皮细胞去分化并重新获得表皮干细胞的表型,这一过程不但可引起hTERT的表达及活性改变,而且能从亚细胞水平上诱导其发生位点迁移。     

耐力运动促进骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢及其对成肌分化的影响

目的:观察耐力运动训练对骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢的影响,并探讨其对成肌分化的调控机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为安静对照组(N组)和运动训练组(T组)。12周训练后,两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度。原代培养并体外诱导成肌分化,倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度。分别在分化0 h和24 h测定线粒体呼吸功能、ATP合成活力、膜电位和MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK、p21蛋白表达量。结果 :免疫化学染色显示desmin阳性细胞>90%,表明获取的卫星细胞纯度高。HE染色结果显示T组腓肠肌肌纤维横截面积显著高于N组(P<0.05)。分化0 h时,T组态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)、线粒体ATP合成活力、p21表达较N组显著升高(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。分化24 h时,T组肌管形成数量及MyHC表达较N组显著升高(P<0.05),ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、p21及COXⅣ表达显著增加(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。结论:耐力运动训练可提高未分化卫星细胞线粒体能量代谢水平,继而抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进成肌分化的启动和进程。