β-谷甾醇靶向调控PI3K3CG基因保护心肌肥厚作用研究

目的 运用网络药理学方法建立通心络活性成分-作用靶点网络,明确靶点相应的生物功能,探讨β-谷甾醇与心肌肥厚之间的作用及途径。方法 通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）收集通心络主要成分及药物潜在作用靶点,通过Cytoscape软件将通心络成分-作用靶点网络可视化,使用DAVID在线工具进行基因的基因本体论（GO）分析和KEGG通路富集分析。通过免疫荧光检测不同浓度的β-谷甾醇对于ISO诱导的H9C2细胞表面积的影响;使用qRT-PCR检测心肌肥厚相关因子的ANP,BNP及β-MHC的表达;使用Western blot检测PI3K3CG的变化;使用H&E染色及心脏超声检测β-谷甾醇对于心脏细胞结构以及心脏功能的改变。结果 通心络中主要有95个活性成分对应180个潜在靶点。通心络与心肌肥厚交集靶基因主要富集在钙离子信号通路、胆碱能突触信号通路及cAMP信号通路等。体内中β-谷甾醇逆转了由ISO诱导的心肌细胞表面积增加,同时,抑制ANP、BNP,PI3K3CG和β-MHC的表达。β-谷甾醇抑制ISO诱导的大鼠心肌细胞肥大作用,包括降低小鼠心肌细胞横截面积,降低IVSD和LVPWD,抑制肥大标志基因ANP、BNP、β-MHC以及PI3K3CG的表达。结论 β-谷甾醇通过抑制PI3K3CG水平,首先调控心肌肥厚相关因子的表达,进而影响心肌细胞肥厚,干预心肌肥厚发展     

肌纤生成调节因子-1促肌节F-actin组装引起新生乳大鼠心肌细胞肥大

目的探索肌纤生成调节因子-1（myofibrillogenesis regulator-1,MR-1）通过调节肌原纤维生成引起心肌肥大的机制。方法干预MR-1在体外培养的新生乳大鼠心肌细胞中的表达,检测心肌细胞表面积、心房利钠因子和脑钠肽水平及蛋白合成速率3种心肌肥大指标的变化,以鬼笔环肽 异硫氰酸荧光素标志并观察肌节F-actin组装,以半定量反转录 聚合酶链反应、免疫印迹和细胞免疫荧光术检测重要肌节分子myomesin-1、肌球蛋白调节轻链-2（myosin light chain-2,MLC-2）含量及亚细胞定位。结果MR-1过表达引起心肌细胞肥大、肌节F-actin组装明显促进、MLC-2与myomesin-1表达上调（P<0.05）以及myomesin-1的细胞核-细胞质转位;MR-1沉默后小泛素样调节因子-1过表达引起的转位和肌节F-actin组装明显抑制。结论MR-1通过促进myomesin-1和MLC-2调节肌原纤维生成引起心肌细胞肥大。     

miR-149-5p靶向FGF21对大鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤的促进作用

目的 探究miR-149-5p与成纤维细胞生长因子21(FGF21)的靶向关系，及其对大鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响。方法 将10只C56BL/6J雄性小鼠构建缺血再灌注(I/R)模型，qRT-PCR法检测I/R小鼠心脏组织中miR-149-5p表达水平的变化。将培养至生长对数期的H9c2大鼠心肌细胞分为对照组、H/R组、H/R+miR-149-5pinhibitor组、H/R+miR-149-5p NC组、H/R+miR-149-5p mimics组、H/R+miR-149-5p mimics+FGF21组，并诱导H/R模型及转染处理。ELISA法检测H9c2细胞中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性；MTT法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡情况；qRT-PCR检测细胞中miR-149-5p的表达水平；Western blotting检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、FGF21蛋白的表达水平；双荧光素酶测定miR-149-5p与FGF21的靶向关系。结果 与假手术组比较，I/R小鼠心脏组织中miR-149-5p表达水平明显升高(P&l...     

miR-885-3p靶向AKT1对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响

目的 探究miR-885-3p对结直肠癌细胞HT-29放射敏感性的影响以及作用机制。方法 荧光定量PCR检测经不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X射线照射后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量;建立过表达miR-885-3p细胞株,功能试验探讨其对HT-29细胞放射敏感性的影响;生物信息学预测miR-885-3p下游调控的靶基因,双荧光素酶报告基因法进一步验证;上调和下调miR-885-3p表达量探讨miR-885-3p与靶基因丝苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）表达量的调控关系;慢病毒转染敲减AKT1表达量,观察其对HT-29细胞放射敏感性的影响;共转染miR-885-3p模拟物,探讨过表达AKT1对miR-885-3p诱导的HT-29细胞放射敏感性的影响。结果 miR-885-3p在放射诱导的HT-29细胞中表达上调（F=46.64,P<0.05）;过表达miR-885-3p和敲减AKT1可通过抑制HT-29细胞存活、促进其凋亡,从而增强HT-29细胞放射敏感性（t=12.33、12.95,P<0.05）,放射增敏比（SER）分别为1.602和1.946;抑制miR-885-3p可通过促进HT-29细胞存活、抑制其凋亡从而促进HT-29细胞放射抵抗（t=11.94,P<0.05）,SER为0.839;AKT1是miR-885-3p下游靶基因;过表达AKT1反转miR-885-3p增强HT-29放射敏感性的作用,SER为0.680。结论 miR-885-3p通过直接靶向AKT1增加结直肠癌HT-29细胞放射敏感性,为提高临床结直肠癌放疗敏感性提供一个靶点。     

左旋甲羟戊酸对辛伐他汀调控心肌细胞PTEN表达的影响

目的：观察左旋甲羟戊酸（L-MVA）对辛伐他汀调控大鼠心肌细胞第十号染色体缺失的张力蛋白同源区（PTEN）表达的影响。方法：应用图像分析及[3H]-亮氨酸掺入法测定细胞表面积及蛋白合成速率,RT-PCR检测心钠素（ANP）mRNA表达,RT-PCR和Western blot法检测PTEN的mRNA和蛋白表达水平。结果：辛伐他汀＋L-MVA组心肌细胞表面积、[3H]-亮氨酸掺入率、ANP mRNA水平均明显高于辛伐他汀组（P〈0.01）,而PTEN的mRNA及蛋白表达水平则明显降低（P〈0.01）。结论：L-MVA能够降低PTEN的表达水平,逆转辛伐他汀对心肌细胞肥大的抑制作用。     

MiR-1207-3p靶向XRCC6对结直肠癌细胞HT-29凋亡的影响

目的 探讨miR-1207-3p靶向X-射线修复交叉补充因子6（X-ray repair cross complementing 6,XRCC6）对结直肠癌细胞HT 29凋亡的影响。方法 运用TargetScan在线分析miR-1207-3p与XRCC6的相关性;将XRCC6的3′端非编码区克隆进pmirGLO载体中,利用双荧光素酶报告系统检测miR-1207-3p是否靶向调控XRCC6基因;用LipoFiter3转染试剂转染miR-1207-3p mimics或miR-1207-3p inhibitor进结直肠癌细胞HT-29后,通过Western Blot检测XRCC6蛋白表达量和结直肠癌细胞HT-29凋亡标志蛋白的表达量;采用Annexin V染色法测定细胞凋亡水平。结果 通过TargetScan分析,miR-1207-3p仅在一个区域与XRCC6具有较高匹配度;通过双荧光素酶报告系统检测发现,miR-1207-3p靶向结合XRCC6的3′端非编码区;过表达miR-1207-3p时,XRCC6的表达量下降,细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量显著上升,细胞凋亡水平上升(t=34.18,P<0.000 1);敲低miR-1207-3p时,XRCC6的表达量上升,细胞凋亡标志蛋白Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表达量显著下降,细胞凋亡水平下降(t=3.375,P=0.027 9)。结论 MiR-1207-3p可通过抑制XRCC6表达量来促进结直肠癌细胞HT-29的凋亡。     

异紫堇碱对宫颈癌SiHa细胞增殖和辐射敏感性的影响

目的 探讨异紫堇碱（ICD）对宫颈癌SiHa细胞增殖和辐射敏感性的影响及其作用机制。 方法 采用不同浓度（25、50、100、200 μmol/L）ICD处理宫颈癌SiHa细胞（简称ICD处理组）,同时将正常培养未经ICD处理的SiHa细胞设为对照（NC）组。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测细胞的增殖抑制率,细胞克隆形成实验检测ICD对细胞辐射敏感性的影响,Western blot检测磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的相对表达量,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测微小RNA-129-5p（miR-129-5p）的表达。在SiHa细胞中分别转染miR-NC和miR-129-5p,观察转染miR-129-5p对细胞增殖、辐射敏感性、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）、γ-H2AX蛋白表达的影响。在SiHa细胞中分别转染anti-miR-NC和anti-miR-129-5p并使用ICD处理,分析其对ICD诱导的细胞增殖、辐射敏感性、PI3K/Akt信号通路的影响。2组间数据的比较采用独立样本t检验。 结果 MTT实验结果显示,与NC组SiHa细胞的增殖抑制率[（0.05±0.01）%]相比,25、50、100、200 μmol/L ICD处理组能够明显提高SiHa细胞的增殖抑制率[（10.26±1.03）%、（22.16±2.21）%、（44.09±4.41）%、（70.88±7.09）%],且差异均有统计学意义（t=29.736~30.013,均P<0.05）。细胞克隆形成实验、Western blot和qRT-PCR结果显示,与NC组相比,100 μmol/L ICD处理组能够明显提高SiHa细胞对不同剂量X射线的辐射敏感性（t=19.135~44.478,均P<0.05）,提高γ-H2AX蛋白和miR-129-5p的相对表达量（t=15.041、19.682,均P<0.05）,降低p-PI3K和p-Akt蛋白的相对表达量（t=14.897、15.429,均P<0.05）。与转染miR-NC组相比,转染（高表达）miR-129-5p组能够明显提高SiHa细胞的增殖抑制率[（75.06±7.51）%对（1.04±0.10）%,t=29.566,P<0.05]、对不同剂量X射线的辐射敏感性（t=13.239~37.015,均P<0.05）和γ-H2AX蛋白的相对表达量（t=17.076,P<0.05）,能够降低cyclinD1蛋白的相对表达量（t=17.393,P<0.05）。与转染anti-miR-NC+ICD处理组相比,转染anti-miR-129-5p（低表达miR-129-5p）+ICD处理组可以反转ICD抑制SiHa细胞增殖、抑制PI3K/Akt信号通路的活性和增强细胞辐射敏感性的作用,且差异均有统计学意义（t=13.370~28.252,均P<0.05）。 结论 ICD能够通过上调miR-129-5p表达及抑制PI3K/Akt信号通路的活性来抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖以及增强其辐射敏感性。     

异丙基肾上腺素充血性心衰大鼠模型NE、AngⅡ的改变

目的建立异丙基肾上腺素（ISO）诱导SD大鼠充血性心力衰竭（CHF）模型,观察血浆NE、AngⅡ的变化。方法应用大剂量ISO（170mg/kg）对SD大鼠皮下注射2次,建立CHF模型,造模后18w测量左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、缩短分数（FS）、左室射血分数（LVEF）;利用酶联免疫方法检测血浆NE和放免法检测血浆AngⅡ水平,并取心肌观察病理形态学特征。结果与对照组（CON）相比,ISO组大鼠心功能明显下降,血浆NE、AngⅡ显著升高;ISO组大鼠心肌细胞肥大,部分心肌细胞有嗜酸变性和（或）坏死,心肌间质结缔组织增生。结论应用大剂量ISO诱导大鼠CHF模型,该作用可能与血浆NE、AngⅡ升高有关。     

X射线诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的适应性反应及相关miRNA筛选的研究

目的 研究X射线辐射诱导非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞凋亡的适应性反应,并筛选适应性反应相关的微RNA（miRNA）。 方法 将NSCLC A549细胞分为6组,包括 50 mGy+20 Gy、200 mGy+20 Gy、20 Gy、50 mGy、200 mGy照射组及对照组（0 Gy）,前2组细胞分别用50、200 mGy初始剂量进行照射,培养6 h后用20 Gy的效应剂量进行照射,20 Gy、50 mGy、200 mGy照射组同时进行照射。培养24 h后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。利用小RNA测序技术筛选差异表达miRNA,并对其靶基因进行基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的功能富集分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对部分差异表达miRNA进行验证。2组间数据的比较采用Welch t检验。 结果 50 mGy+20 Gy照射组和200 mGy+20 Gy照射组的A549细胞早期凋亡率分别为（1.81±0.11）%和（2.17±0.19）%,低于20 Gy照射组的（4.54±0.23）%,且差异均有统计学意义（t=10.680、8.006,均P<0.01）。与20 Gy照射组相比,50 mGy+20 Gy照射组和200 mGy+20 Gy照射组共同差异表达趋势miRNA有1个上调（miR-3662）、15个下调（miR-185-3p、miR-1908-5p、miR-1307-5p、miR-182-3p、miR-92a-3p、miR-582-5p、miR-501-3p、miR-138-5P、miR-1260b、miR-484、miR-378d、miR-193b-3P、miR-127-3p、miR-1303及miR-654-5p）。GO富集分析结果显示,差异表达miRNA调控靶基因功能显著富集于细胞通讯调节、代谢过程的正向调节、代谢信号的调节、酶结合及催化活性等过程。KEGG富集分析结果显示,靶基因相关信号通路显著富集于溶酶体、丝裂原活化蛋白激酶、Ras和内吞作用等信号通路。qRT-PCR检测结果显示,miRNA表达情况与基因芯片结果趋势一致（10个miRNA表达水平得到验证）。 结论 X射线50、200 mGy照射剂量均能诱导NSCLC A549细胞凋亡的适应性反应,并筛选到一组共同差异表达的miRNA,可能在X射线辐射诱导细胞凋亡的适应性反应中发挥了重要作用,有可能成为调节电离辐射生物效应的潜在靶点。     

miR-181a调控PINK1/Parkin通路对骨质疏松大鼠破骨细胞线粒体自噬的影响

目的 探讨miR-181a调控PTEN诱导激酶1（PINK1）/帕金森病相关基因（Parkin）通路对骨质疏松（OP）大鼠破骨细胞线粒体自噬的影响。方法 健康雌性SD大鼠20只,随机分为OP模型组（n=10）与对照组（n=10）。OP模型组大鼠制备OP模型,提取OP大鼠破骨细胞,设置OP组（未转染）、si-miR-181a组（转染si-miR-181a载体质粒）、si-NC组（转染si-NC阴性对照质粒）、ad-miR-181a组（转染ad-miR-181a载体质粒）与ad-NC组（转染阴性ad-NC对照质粒）,对照组大鼠破骨细胞正常培养,设为正常对照组。采用RT-PCR检测miR-181a的表达,MTT法及流式细胞术检测破骨细胞的存活及凋亡情况,透射电镜观察线粒体自噬情况,免疫荧光共定位检测线粒体中Parkin的表达情况,Western blotting检测PINK1/Parkin及自噬、凋亡相关蛋白的表达情况。敲低OP大鼠破骨细胞miR-181a后下调Parkin的表达,验证Parkin对miR-181a的逆转作用。双荧光素酶报告实验验证miR-181a与Parkin的靶向调控关系...