Wnt信号通路在创伤微环境诱导的表皮细胞去分化过程中的作用

目的 研究创伤微环境对表皮细胞的去分化诱导作用,并探讨Wnt通路在这一过程中的作用. 方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞.处理后的表皮片经免疫组化鉴定后移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5 d后用免疫组化法检测皮片内细胞的表型特征,RT-PCR和Western blot检测表皮细胞表型转化过程中Wnts分子及下游分子的表达变化. 结果 未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性.而去基底皮片移植后5 d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞.同时在移植皮片内Wnt-10b、Wnt-4和Wnt-7a mRNA的表达分别增加了3.1倍、2.2倍和1.4倍,而Wnt通路下游β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达分别增加了3倍、1.5倍和2倍(P<0.01). 结论 创伤微环境可诱导表皮细胞去分化,Wnt/β-catenin信号通路可能在这一过程中起关键性的调控作用.     

去分化来源表皮干细胞的分离与鉴定

目的 分离培养和鉴定去分化来源的表皮干细胞.方法 采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞,采用Ⅳ型胶原黏附法分离获得去分化来源的表皮干细胞.观察去分化来源表皮干细胞的形态及增殖特点,并通过免疫细胞化学、免疫荧光及流式细胞技术对其形态和表型进行鉴定.结果 去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、CK19、CK14等,而CK10的表达为阴性.激光共聚焦检测显示a6整合素和CD71在去分化来源表皮干细胞及其亚群中的分布均存在着区域性差异.此外,流式细胞检测结果显示去分化来源的表皮干细胞中主要包含a6+CD71-和a6+ CD71+的两种细胞群落,分别占被检测细胞总数的24.52%±7.88%及66.97%±5.04%.结论 去分化来源的表皮干细胞与机体自身来源的表皮干细胞在形态和表型上具有相似性,可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.     

体外诱导表皮细胞去分化的初步实验研究

目的 建立表皮细胞去分化体外模型,探索与去分化过程有关的信号通路.方法 分离培养人表皮细胞,分别用双氧水、ERK阻断剂PD98059加双氧水处理细胞,采用免疫细胞化学染色法和Western blot法检测不同方式处理后表皮细胞表型的变化情况,Western blot法检测双氧水处理后ERK信号通路相关蛋白的表达情况.结果 双氧水处理后,表皮细胞干细胞标志物(CK19、β1整合素、Oct4和p63)表达增加,分化细胞标记物(CK10)表达减少,ERK信号通路中相关的磷酸化蛋白表达增强.以PD98059阻断ERK通路的活化后,双氧水诱导的表皮细胞表型逆转受到了抑制.结论 ERK通路参与了双氧水诱导的表皮细胞去分化过程.     

人胎儿不同发育时期皮肤β1整合素、角蛋白19,10表达特征及其与创面无瘢痕愈合关系的研究

目的 观察不同发育时期人胎儿皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞分布、增殖分化特征，并探讨这些特征与胎儿表皮再生的关系。方法 分别取21例不同胎龄（11－31周）全层皮肤，用免疫组织化学SP法观察β1整合素、角蛋白19（K19）和角蛋白10(K10)的表达特征。结果 全部标本表皮基底层细胞均为β1整合素和K19阳性细胞。11－31周的表皮外层可观察到K10阳性细胞。随胎龄增加，K10阳性细胞层数逐渐增多。结论 人胎儿期表皮基底层增殖细胞主要为表皮干细胞和短暂扩充细胞。随胎龄增加，终末分化细胞的比例明显增高。这可能与胚胎早期胎儿皮肤创面无瘢痕愈合有关。     

少儿瘢痕组织和正常皮肤表皮干细胞增殖分化特征的比较研究

研究少儿增生性瘢痕组织和正常皮肤表皮干细胞增殖分化特征与规律的差异，探讨这些差异与烧伤后创面瘢痕愈合的关系。采用免疫组织化学E1ivision两步法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10。结果显示，少儿增生性瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少，阳性强度降低。其瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层，明显少于健康皮肤，而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛。提示少儿增生性瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤，且其瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同，处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低，而终末分化细胞的比例明显增高。少儿瘢痕组织表皮的修复能力下降，细胞的分化行为紊乱，这可能是少儿瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一。     

碱性成纤维细胞生长因子对表皮细胞中端粒酶反转录酶表达的影响

目的观察表皮细胞去分化过程中人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达差异及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响。方法采用bFGF诱导表皮细胞去分化形成表皮前体干细胞,免疫细胞化学染色法检测bFGF诱导培养后表皮细胞表型的改变,并用流式细胞法、免疫荧光染色及TRAP-银染法检测bFGF诱导培养后表皮细胞中hTERT的表达差异。以同等条件下未经bF-GF处理的人表皮细胞为对照组,同期分离培养的人在体表皮干细胞为阳性对照组。结果免疫细胞化学染色显示,bFGF诱导培养后表皮细胞中β1-integrin、CK19、CK14表达明显增强,而CK10表达明显降低。流式细胞仪检测显示,bFGF诱导后实验组、对照组及阳性对照组hTERT阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的98.41%、0.77%及99.76%。TRAP-银染法检测显示实验组hTERT表达活性明显上调,且与阳性对照组比较无显著差异。间接免疫荧光染色显示实验组去分化来源表皮干细胞和在体表皮干细胞中的hTERT分布存在着亚细胞位点差异。结论 bFGF可诱导表皮细胞去分化并重新获得表皮干细胞的表型,这一过程不但可引起hTERT的表达及活性改变,而且能从亚细胞水平上诱导其发生位点迁移。     

创面收集液对表皮干细胞表型的影响

目的 探讨全层创面收集液对表皮干细胞类型的影响。方法 以聚氨酯海绵收集成年Wistar大鼠背部全层创面渗出液；以快速黏附分离法体外分离、培养新生Wistar大鼠的表皮干细胞，待表皮干细胞呈克隆生长时加入创面收集液干预，分别于干预后的0，6，12，18，24，30，36，42，48，54，60，72h采用流式细胞仪及β1整合素、角蛋白19，14，10免疫组化染色进行细胞增殖分化的鉴定。结果表皮干细胞在创面收集液干预后仍可持续保持片状聚集生长的态势，但出现数量较多的角蛋白14阳性染色细胞群落，且随时间延长该阳性细胞群落呈上升趋势；另出现了散在的角蛋白10染色阳性细胞。结论创面收集液可以快速诱导体外培养表皮干细胞进入分化状态，且多表现为短暂扩充细胞表型，在该过程中表皮干细胞数量仍可维持在一定的水平。     

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化特征及其与创面修复结局关系的研究

为从细胞分化角度研究人胎儿期，少儿期，成年人期皮肤中表皮干细胞增殖分化特征，以及这些特征与创面修复结局的关系，分别取因创伤等原因致流产的22－24周龄胎儿和4－12周岁少儿，35－53岁成年人3组全层皮肤，采用免疫组化方法检测表皮干细胞特异表达的β1整合素和细胞角蛋白19（K19）， 结果发现，胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整合素和K19染色均为强阳性，少儿期表皮基底层细胞中60％－80％的细胞表达β1整合素和K19，成年人表皮基底层中表达β1整合素和K19的细胞较少儿组进一步减少，且染色强度较弱，结果提示，胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩充细胞，而少儿期表皮基底层中部分细胞为干细胞和短暂扩充细胞，成年人期干细胞与短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低，这种干细胞增殖分化的差异可能与三种不同发育阶段皮肤损伤的完全与不完全修复有关。     

表皮干细胞体外分离与培养

探索和建立表皮干细胞体外分离与培养的技术方法。通过酶消化法获得幼鼠表皮 ,并制成单表皮细胞悬液 ,以表皮干细胞培养基 ,即无钙EMEM培养基 (添加 9%FBS ,0 0 5mmol/LCaCl2 ,4ng/mlEGF ,0 5ng/ml硫酸庆大霉素及 5 0 %成纤维细胞条件培养基 )置细胞培养箱内培养。成纤维细胞条件培养基为无钙EMEM培养基(添加 9%FBS、0 0 5mmol/LCaCl2 、0 5 μg/ml硫酸庆大霉素 )培养幼鼠皮肤块 4 8h后所得培养液。将 1×10 6/ml上述培养的角质形成细胞经TGG细胞消化液 37℃下振荡消化后 ,接种至鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内 ,37℃下静置 10～ 15min,留用快速贴壁细胞继续培养 ,所得细胞分别以能否呈克隆状生长和透射电镜观察其超微结构及β1整合素、K19免疫细胞化学染色进行鉴定。结果显示 ,鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞经继续培养 ,可见细胞呈克隆状生长。电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征 ,β1整合素、K19免疫细胞化学染色阳性。研究表明 ,表皮干细胞可在体外分离与培养 ,本实验方法为较好方法之一。     

一种表皮干细胞检测方法的建立

1975年以来 ,表皮细胞膜片应用于封闭深度烧伤创面取得了一定的效果[1～ 3 ] ,但所得到的细胞膜片中大部分细胞为终末分化细胞 ,已失去进一步增殖的能力。因此如何保持表皮细胞较强的分裂增殖能力或者说干细胞特性 ,是提高表皮细胞膜片移植存活率及在体外获得工程化皮肤的技术关键之一。表皮干细胞是组织工程化皮肤的种子细胞之一 ,但由于缺乏单一的、特异性的鉴别标志 ,使得其分离和获得十分困难。本研究试图利用流式细胞仪检测表皮干细胞表面整合素 β1 (CD2 9)和细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)的荧光标记强度 ,建立简便易行的表皮干细胞…     

人羊膜不同位置上皮细胞的类胚胎干细胞性质差异研究

目的了解足月人羊膜上皮不同位置上皮细胞在类胚胎干细胞性质方面的异质性。方法分层消化收集人羊膜上皮近表层与近基底层细胞,运用流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等方法观察测定其干细胞表面抗原及分子标记物Nanog、Oct4、Sox2、SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、CD73的表达情况;同时将足月人羊膜全层及经胰酶消化去上皮后的人羊膜行组织学染色,测定SSEA3、TRA1-60、TRA1-81表达情况。结果人羊膜上皮近基底层细胞表达Nanog、Oct4、Sox2、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81普遍高于近表层细胞;表达SSEA4最强、最显著的细胞主要为较小的近圆形细胞,分布于羊膜上皮近基底层处。结论人羊膜上皮不同位置细胞的干细胞特性不同,近基底层细胞比近表层细胞具有更强的类胚胎干细胞性质,因而有望成为临床干细胞的来源。     

PET人工韧带材料纳米化对骨髓基质干细胞粘附、增殖及分化影响的实验研究

目的:观察人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)在经过表面纳米化处理的PET人工韧带材料表面的粘附、增殖及成骨分化。方法:根据PET膜片表面处理情况分为PET组(PET膜片未经表面处理)、LBL组(PET膜片表面经透明质酸、壳聚糖纳米自组装涂层处理)和HA组(PET膜片经透明质酸、壳聚糖纳米自组装处理后,表面再加纳米羟基磷灰石涂层)3组。在上述3种PET材料上分别培养hBMSCs后进行各项检测。扫描电镜(SEM)观察hBMSCs在材料上培养1天和7天时的细胞形态。培养7天后,Alamar blue法检测hBMSCs的增殖,pNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性。RealTimePCR检测培养3天hBMSCs的整合素β1mRNA表达。结果:SEM显示HA组和LBL组hBMSCs能更好地伸展和粘附,形态明显优于PET组。培养7天,HA组和LBL组的细胞增殖、ALP活性定量均显著高于PET组(P<0.001);HA组细胞增殖显著高于LBL组(P=0.01),HA组ALP活性显著高于LBL组(P<0.001)。培养3天后,HA组和LBL组hBMSCs的整合素β1mRNA表达显著高于PET组(P<0.001),HA组显著高于LBL组(P=0.003)。结论:PET人工韧带材料表面经壳聚糖、透明质酸纳米自组装涂层和纳米羟基磷灰石涂层处理后,能明显促进人hBMSCs的粘附、增殖和分化。纳米羟基磷灰石涂层的作用最明显。     

应用生物反应器体外培养骨软骨复合体修复犬关节软骨损伤

目的 探讨应用灌注型生物反应器体外培养骨软骨复合体修复关节软骨损伤的可行性. 方法 体外分离犬骨髓间充质干细胞(MSCs),流式细胞仪鉴定.经过生长因子诱导生成软骨细胞和成骨细胞后,免疫组化及碱性磷酸酶等染色鉴定.将软骨细胞、成骨细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙(β-TCP)陶瓷支架材料上,置于灌注型生物反应器中复合培养21 d,构建骨软骨复合体,扫描电镜观察细胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情况,并模仿马赛克骨软骨移植术用塑形良好的骨软骨复合体修复犬软骨缺损,切片染色观察其修复情况. 结果 扫描电镜显示软骨细胞、成骨细胞在β-TCP支架上的黏附、伸展和增殖良好,实验组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近.实验组与阴性时照组比较,差异有统计学意义(q=12.337 0,P＜0.01);与空白对照组比较,差异有统计学意义(q=31.5393,P＜0.01). 结论 灌注型生物反应器使软骨和成骨细胞在三维载体内存活并增殖,提高细胞在载体内的复合效率.     

A histological study on the mechanism of epidermal nuclear elongation in electrical and burn injuries

Epidermal nuclear elongation is one of the most important signs for the diagnosis of electrical injury. In this study, we investigated the mechanism responsible for this phenomenon by comparing the findings from burn injuries and those from contusions. Electrical and burn injuries were made in the dorsal skin of rats using energy ranging from 100 to 790 joules for electrical injury, and 170-690 joules for burn injury. Contusions were also made by compressing the skin with a vice. In electrical and burn injuries, the dermis under the epidermal elongated nuclei was homogeneous and without empty spaces between collagen bundles and the number of dermal fibroblasts per 0.01 mm2 below the damaged epidermis decreased significantly (P < 0.05). The incidence of this change correlated with the depth of denatured dermal collagen fibres and in both types of injuries, dermal cells had no nuclear antigenicity for ubiquitin. The width of the injured epidermis with nuclear elongation decreased significantly (P < 0.05) and the elongated nuclei were parallel to the basal membrane. In electrical injury however, nuclear elongation occurred more frequently near the external root sheath. Nuclear elongation of fibroblasts and external root sheath cells was also found, but those of sebaceous gland cells were not detected. Epidermal elongated nuclei were also found in contusions. The evidence strongly suggests that epidermal nuclear elongation in electrical and burn injuries is due to dermal expansion by heat.     

应用人脐带血间充质干细胞修复小鼠皮肤缺损创面

目的 探讨人脐带血间充质干细胞(hUCB MSCs)在体分化为皮肤细胞、修复皮肤缺损创面的可能性. 方法 分离hUCB MSCs,体外培养、扩增并用BrdU标记后,种植于重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠背部全层皮肤缺损创面(治疗组),并设同体PBS对照组.于术后7,14 d观察并比较愈合率;于术后7,14,28 d创面活检,行常规病理组织切片HE染色、免疫组织化学染色检测BrdU及人角蛋白19的表达. 结果 术后7,14 d治疗组创面愈合率为(56.06±3.04)%和(94.75±1.89)%,对照组为(36.99 ±2.17)%和(84.63 ±2.28)%,治疗组高于对照组(P＜0.01).HE染色显示治疗组活检组织表皮层明显增厚,细胞及表皮嵴数目显著增多;在再生表皮的毛囊内层以及表皮基底层、棘层可见BrdU阳性标记细胞连续分布,且有部分细胞表达人角蛋白19;并在治疗组活检组织中发现有皮肤附属器形成. 结论 hUCB MSCs可在体分化为皮肤细胞与组织,可应用于皮肤创面的修复.     

整合素β-1对绒毛膜癌细胞耐药的影响

目的：探讨耐药绒毛膜癌细胞粘附分子β-1整合素的表达以及其对细胞凋亡的影响,并寻找逆转耐药的途径。方法：采用人绒毛膜癌细胞株JER及耐足叶乙甙细胞株JEG,免疫组化方法检测绒癌细胞和耐药细胞β-1整合素的表达;MTT法、TUNEL法检测其对细胞凋亡的影响。结果：敏感细胞JER、耐药细胞JEG中均有β-1整合素的表达,但耐药细胞的β-1整合素表达总体水平高于敏感细胞（P〈0．01）;在敏感细胞及耐药细胞中加入纤维粘连蛋白FN其凋亡率与未结合FN的细胞相比有明显差异（P〈0．01）;在敏感细胞及耐药细胞中加入抗β-1整合素抗体阻断细胞与β-1整合素的结合,同时加入纤维粘连蛋白FN,其凋亡率与只加入FN时相比差异有显著性（P〈0．01）。结论：耐药绒癌细胞β-1整合素表达增加,成为耐药表型;其机制主要通过抑制细胞凋亡产生耐药;阻断其作用可以逆转肿瘤耐药。     

肿瘤干细胞标志物ABCG2、CK19和P63在皮肤日光性角化病、Bowen病及鳞状细胞癌中的表达差异及意义

目的检测肿瘤干细胞标志物ABCG2、CK19和P63在皮肤鳞状细胞癌及其癌前病变组织中的表达及意义。方法选取2010年10月-2011年8月在中国医学科学院皮肤病研究所经病理学确诊的组织学标本37例,其中日光性角化病(AK)10例,Bowen’s病(BD)14例,鳞状细胞癌(SCC)13例。采用免疫组织化学MaxVision法检测ABCG2、CK19、P63在各类病变组织中的表达及程度,计算各分子在病变组织中的阳性表达百分率。结果 ABCG2和CK19的阳性反应物定位于细胞膜和细胞质,在SCC中两种分子的阳性细胞率(22.1%±12.6%,23.5%±18.5%)显著高于AK(7.1%±6.6%,5.7%±4.5%)和BD(10.8%±9.1%,6.6%±4.9%,P﹤0.01),而AK与BD比较差异无统计学意义(P>0.05)。AK、BD和SCC中ABCG2和CK19阳性病例的比例逐渐增加(ABCG2为40.0%、71.4%、84.6%,CK19为40.0%、50.0%、92.3%)。P63阳性反应物定位于细胞核,在AK、BD和SCC的所有病例中均呈阳性,其阳性细胞分别为50.5%±17.1%、56.3%±19.8%、43.5%±21.6%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ABCG2、CK19和P63阳性表达程度可能与皮肤鳞状细胞癌的发生发展有关,可作为临床鳞癌患者预后评估的参考。     

CyclinD1、P27、CK19、ALDH1A1在乳腺病变中表达及意义

目的探讨细胞周期D1(Cyclin D1)、P27、细胞角蛋白19(CK19)、ALDH1A1在乳腺病变中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测79例乳腺组织标本(包括正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌)中Cyclin D1、P27、CK19、ALDH1A1的表达情况,分析其与乳腺癌干细胞增殖及乳腺病变组织分化程度之间的关系。结果正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌中Cyclin D1、ALDH1A1的表达逐渐上升,P27、CK19的表达逐渐下降;乳腺正常及良性增生组织中Cyclin D1、CK19、ALDH1A1的表达明显低于乳腺导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05);乳腺正常及良性增生组织中P27的表达明显高于导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05)。结论 Cyclin D1、P27相互作用调节乳腺癌干细胞的发生及发展过程,CK19、ALDH1A1可作为乳腺癌诊断及恶性程度评估的参考指标。