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胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。 相似文献
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采用定点整合表达技术构建t-PA表达CHO工程细胞株 总被引:1,自引:0,他引:1
运用Flp InTM 定点整合表达系统构建表达组织型纤溶酶原激活剂 (tissue type plasminogenactivator ,t PA)的CHO工程细胞株。将pcDNA5 /FRT载体和携带t PA基因的 pJOD S载体用Hind/KpnI双酶切 ,再将回收的 2 .0kbt PAcDNA片段和pcDNA5 /FRT载体连接 ,构建 pcDNA5 /FRT/t PA质粒 ;应用Flp InTM定点整合表达系统 ,将t PAcDNA定点插入Flp lnTM CHO细胞基因组中的 1个单拷贝位点上 ,以潮霉素B筛选定点整合t PAcDNA的细胞克隆。经筛选和体外纤维蛋白溶解活性检测 ,获得了t PA表达水平为 15 0 0~ 2 0 0 0IU/ (10 6cells·day)的CHO工程细胞株。 相似文献
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目的 构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,并检测其在人胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达.方法 以人脐血单核细胞的RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因,并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中,构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA.经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后,用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞,转染后24 h和48 h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达.结果 pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带,测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致.在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞,并在其中得到了表达.结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA,为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础. 相似文献
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陈文江 《中国现代药物应用》2013,7(3):129-131
目的模拟HIV-1包膜糖蛋白天然构象,在真核细胞中高效表达三聚体包膜糖蛋白。方法本研究以原代HIV-1分离株06044包膜为研究对象,将不含信号肽序列的包膜gp120基因克隆至含有人类组织型纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽序列的真核表达载体上,构建单体形式gp120蛋白表达载体;或将其克隆至含有tPA信号肽序列和蛋白质三聚化模序MTQ的真核细胞表达载体上,构建三聚体形式gp120蛋白表达载体。gp120重组表达载体体外瞬时转染293T细胞,westernblot检测表达情况。结果获得gp120蛋白单体和三聚体的真核细胞表达载体peT.06044gp120m/co和pcT-06044gp120T/co;重组质粒瞬时转染293T细胞后westernblot分析,在变性条件下,两组细胞培养上清均检测到单体形式gp120蛋白;非还原条件下,peT.06044gp120T/co转染组的细胞培养上清中检测到三聚体、二聚体和单体三种形式gp120蛋白,其百分比分别为76%、14%和10%。结论本研究成功构建了HIV-1原代06044株包膜gp120单体和三聚体表达载体,并在哺乳细胞中成功表达了gp120单体和三聚体蛋白。 相似文献
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选用大肠杆菌L-门冬酰胺酶(ASPsⅡ)高效表达质粒pKA作为融合表达载体,将水蛙素Ⅲ(HV3)人工合成编码基因插入 pKA质粒的 ASPsⅡ编码基因 ansB中,使 ASPs Ⅱ1N端的 89个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 HV3形成融合蛋白,从而构建成 ASPsⅡ-HV3融合蛋白表达质粒 pKAH,通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 pUC高拷贝数复制原点,进而构建成ASPsⅡ-HV3融合蛋白高效表达载体 pUKAH。该质粒在大肠杆菌 JM105宿主细胞中表达后,融合蛋白(15. 6 kD)占细菌总蛋白 10 5%,该融合蛋白经 CNBr切割释放出活性水蛭素分子,抗凝血活力达约 20 ATU/ml培养液,为以后进一步研究打下了基础。 相似文献