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目的建立检测地特胰岛素原料中宿主DNA残留量的荧光定量核酸扩增(Real-time PCR)方法并进行验证,用于该产品的质量控制。方法选择酿酒酵母5s RNA作为靶基因设计引物,提取地特胰岛素原料中的残留宿主DNA,采用Real-time PCR SYBRGreen染料法对标准DNA和样品进行测定,绘制标准曲线并分析样品中的DNA残留量。对建立的方法进行方法学验证,并测定3批地特胰岛素原料中的残留宿主DNA。结果酿酒酵母基因组DNA质量浓度在0.18~180000ng/mL线性良好(r~2=0.998 5);回收率均在80.0%~106.3%,检测3批地特胰岛素原料的宿主DNA残留量均低于进口药品注册标准限度。结论该方法可用于酿酒酵母生产的地特胰岛素原料中残留宿主DNA的定量测定。 相似文献
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目的:对荧光染色法测定生物制品中的 DNA残留量进行初步的研究和分析,确定该方法用于 DNA质量控制的可行性。方法依据《中国药典》2010年版三部附录ⅨB《外源性DNA残留量测定法》之荧光染色法。结果该方法的线性、重复性、回收率均能满足生物制品中DNA残留量检测的要求,如果用作生物制品行业适用的检测方法,应制备统一的DNA标准品。结论该方法具有简便、快速、可定量分析等优点,可基本满足生物制品行业对DNA残留量质量控制的要求。 相似文献
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目的: 对荧光染色法测定重组酵母乙肝疫苗原液中残留DNA的影响因素进行探索分析,以了解该方法对本疫苗残留DNA检定的适用性。方法: 参照探针杂交法对乙肝疫苗原液残留DNA的测定结果,对乙肝疫苗原液中可能存在Tween-20、PEG、蛋白等物质对荧光染色法测定残留DNA含量的影响进行分析,对该方法的线性范围、用于乙肝疫苗原液残留DNA检定的准确性和重复性进行了研究,并对不同来源DNA标准存在的差异进行比较。结果: 荧光法测定酵母乙肝疫苗残留DNA线性范围为2.5 ng.mL-1~80 ng.mL-1;发现Tween-20、PEG等对残留DNA检测影响较小,加标回收率均在80%-120%之间;而蛋白质对检测影响较大,经酚-三氯甲烷抽提后可有效去除蛋白质干扰,回收率达到90%左右,CV小于10%;同时发现不同来源的DNA标准品存在荧光标记效率的差异。 结论: 乙肝疫苗原液经处理去除蛋白干扰后可采用荧光染色法进行残留DNA含量的测定,但应注意使用与疫苗表达系统相同宿主来源的DNA标准品。 相似文献
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应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量 总被引:8,自引:0,他引:8
目的:建立荧光微量 DNA 含量测定方法,用于重组细胞因子的质量控制。方法:应用 PicoGreen 荧光试剂与 DNA 结合能产生可激发荧光的复合物、再用荧光酶标仪对复合物进行检测并用 SOFTmaxPRO 分析软件进行分析。结果:该荧光法 DNA检测灵敏度达到312 pg·mL~(-1),DNA 含量在0.31~80n·mL~(-1)范围内线性良好,r≥0.996。应用该法对7种重组细胞因子共13批制品的外源 DNA 含量进行测定,结果表明:除重组人 BMP 和 IL-11以外,其它重组细胞因子 DNA 含量均小于10ng·剂量~(-1),与地高辛标记的 DNA 杂交试验结果基本一致。结论:该方法具有简便、快速、自动化程度高等特点,可用于重组细胞因子残余外源 DNA 含量的常规检定。 相似文献
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目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法。方法:提取Vero细胞基因组DNA,设计细胞基因组高度重复顺序AGMr(HindIII)-1基因片段的特异性引物,通过PCR扩增AGMr(HindIII)-1序列中一段特异性cDNA片段,克隆至pGEM-T Vector,重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr(HindIII)-1-S。结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检测标准品,均取得了良好的结果,其检测灵敏度分别达到了0.03 fg.μL-1和0.03 pg.μL-1。结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量。 相似文献
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重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的DDNA残留量检测 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTrail)是一种治疗肿瘤的蛋白药物.其质量控制中,参照2005年<中华人民共和国药典>第三部规定,单支剂量的外源性DNA含量不应超过10ng.通过纯化,我们得到重组大肠杆菌表达的rhTrail蛋白,对其进行了DNA残留检测.方法:参照固相斑点杂交和地高辛核酸探针法,利用DNA地高辛标记和检测试剂盒,制备了地高辛标记宿主DNA探针,对三个rhTrail样品进行DNA残留检测.结果:杂交膜上,宿主DNA带显色,颜色按DNA上样量高低由深至浅,呈梯度差异,三个rhTrail蛋白样品的上样带颜色均较参比的宿主DNA100pg上样带颜色浅.结论:通过换算,三个样品单支剂量的DNA残留均低于10ng,符合DNAA残留要求. 相似文献
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目的:建立重组人源化兔抗VEGF单抗的质控方法和质量标准。方法:利用HUVEC细胞增殖抑制试验测定重组人源化兔抗VEGF单抗的生物学活性;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定纯度;胰酶酶切,HPLC测定其肽图;实时定量PCR检测CHO宿主DNA残留量;采用ELISA法分别测定VEGF结合力、残留ProA含量和残留菌体蛋白含量;水平等电聚焦电泳法测定等电点;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人源化兔抗VEGF单抗的原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。 相似文献
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Insulin is a essential molecule for type I diabetes that is marketed by very few companies. It is the first molecule, which was made by recombinant technology; but the commercialization process is very difficult. Knowledge about biochemical structure of insulin and human insulin genome sequence map is pivotal to large scale manufacturing of recombinant DNA Insulin. This paper reviews human insulin genome sequence map, the amino acid sequence of porcine insulin, crystal structure of porcine insulin, insulin monomer, aggregation surfaces of insulin, conformational variation in the insulin monomer, insulin X-ray structures for recombinant DNA technology in the synthesis of human insulin in Escherichia coli. 相似文献
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甘精胰岛素的临床评价 总被引:1,自引:0,他引:1
甘精胰岛素是由DNA重组技术制备的一种重组人胰岛素类似物,为长效降糖药。甘精胰岛素的作用较为平稳,血浓度无峰值,作用时间持久(可达24h)。因此,每天1次剂量如同生理基础胰岛素。甘精胰岛素的不良反应主要为低血糖,但其夜间低血糖的发生率明显低于其他某些胰岛素制剂。 相似文献
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We propose a method for determining the criticality of residual host cell DNA, which is characterized through two attributes, namely the size and amount of residual DNA in biopharmaceutical product. By applying a mechanistic modeling approach to the problem, we establish the linkage between residual DNA and product safety measured in terms of immunogenicity, oncogenicity, and infectivity. Such a link makes it possible to establish acceptable ranges of residual DNA size and amount. Application of the method is illustrated through two real-life examples related to a vaccine manufactured in Madin Darby Canine Kidney cell line and a monoclonal antibody using Chinese hamster ovary (CHO) cell line as host cells. 相似文献
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The comet assay (single cell gel electrophoresis) is the most common method for measuring DNA damage in eukaryotic cells or disaggregated tissues. The assay depends on the relaxation of supercoiled DNA in agarose-embedded nucleoids (the residual bodies remaining after lysis of cells with detergent and high salt), which allows the DNA to be drawn out towards the anode under electrophoresis, forming comet-like images as seen under fluorescence microscopy. The relative amount of DNA in the comet tail indicates DNA break frequency. The assay has been modified to detect various base alterations, by including digestion of nucleoids with a lesion-specific endonuclease. We describe here recent technical developments, theoretical aspects, limitations as well as advantages of the assay, and modifications to measure cellular antioxidant status and different types of DNA repair. We briefly describe the applications of this method in genotoxicity testing, human biomonitoring, and ecogenotoxicology. 相似文献
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目的观察每日3次诺和锐30对初诊2型糖尿病的疗效。方法选择许昌市中心医院2009年10月至2010年10月新诊断的T2DM住院患者(诊断按WTO1999年标准)60例,随机分为MDI组及诺和锐30组治疗两周,比较PG、c肽、血糖达标时间、胰岛素日用量和低血糖发生人数。结果两组组内比较均有明显改善,差异具有统计学意义(P<0.01)。两组间无统计学意义(P>0.05)。结论每日3次诺和锐30能有效降低血糖,改善β细胞功能,有效降低低血糖事件的发生,可作为初诊2型糖尿病的强化治疗方案。 相似文献