口服脊髓灰质炎疫苗神经毒力试验新方法

口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)的猴体神经毒力试验(NT)是检测Sabin株减毒活疫苗各批间生产一致性的重要试验,并对OPV在人体应用的安全性作出了重要贡献。由于使用灵长目动物日益受到反对,发展新的替代试验来检测疫苗的神经毒力显得越来越重要。在世界卫生组织(WHO)全球疫苗和免疫计划(GPVI)及WHO生物制品专家的倡导下,分别进行了应用表达脊髓灰质炎病毒(PV)受体的转基因(TgPVR)小鼠和聚合酶链反应(PCR)及限制性内切酶酶切技术作突变分析(MAPREC)对Ⅲ型OPV质量检测的国际协作研究。在1995年9月26～28日召开会议,回顾了TgPVR小鼠和MAPREC在Ⅲ型PV研究中的结果,讨论了在Ⅰ、Ⅱ型PV上应用的可能性及在OPV质量控制方面的应用前景。本文对此会议内容作一简单介绍。     

Ⅰ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒Sabin疫苗株间的重组病毒可作为候选Ⅲ型活疫苗株

本文报道在脊髓灰质炎病毒Mahoney株与和减毒Ⅰ型Sabin株间进行重组,应用感染性cDNA克隆构建了4个重组病毒:PV1(SM)IC-8b、PV1(SM)IC-11b、PV1(SM)IC-8a和PV1(SM)IC-11a。这4个重组病毒与其亲本株Mahoney和Ⅰ型Sabin株进行比较,包括猴神经毒力试验和体外表型特征试验。结果表明,主要编码病毒核壳蛋白的基因区段与神经毒力或减毒表型几乎没有关系,影响Ⅰ型病毒神经毒力或减毒表型的主要位点在基因组5′端非编码区。编码核壳蛋白的基因区域表现出对Ⅰ型病毒的神经毒力和减毒表型仅有微弱影响,     

构建细小核糖核酸病毒活疫苗的策略

利用感染性cDNA克隆,已构建了若干1型脊髓灰质炎病毒Mahoney有毒株与sabin1减毒株之间的重组病毒。这些重组病毒的猴体神经毒力试验表明,病毒颗粒的表面结构与神经毒力表型有些相关,神经毒力强的决定簇位于5′端非编码序列。这些结果产生了两种构建活的小核糖核酸病毒减毒株的可能的策略。一种是利用Sabin 1株作为携带外来抗原的载体:另一种是在5′端非编码序列引入突变来构建减毒的细小核糖核酸病毒。Sabin 1株的抗原性成功地改变为脊髓灰质炎病毒其他血清型的抗原性,而疫苗质量不降低。还证明,在Sabin 1株和Mahoney株基因组的5’端非编码序列引入缺失突变可构建具有弱神经毒力表型的病毒。     

在Vero细胞内传代的脊髓灰质炎Sabin减毒疫苗株中突变株的累积分析

口服脊髓灰质炎疫苗 ( OPV)是全球消灭脊髓灰质炎的主要手段。有经验显示Sabin疫苗病毒在 Vero细胞中培养的毒力回复突变比在原代猴肾细胞中培养的高。本研究以聚合酶链反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析 ( MAPREC) ,分析经 Vero细胞或次代绿猴肾 ( s GMK)细胞培养的脊髓灰质炎 Sabin疫苗病毒中含神经毒力基因的病毒比例 ,评估两种细胞传代后疫苗病毒的遗传学稳定性 ,来确证 OPV病毒在 Vero细胞中培养的安全性。　　在 33.3℃ ,低感染复数 ( MOI)状态 (约1 0 - 3.5CCID50 /细胞 ,正常的 OPV生产状态 )下 , 型病毒 IS- 77N…     

脊髓灰质炎病毒Sabin株的感染性cDNA克隆可作为口服脊髓灰质炎活疫苗的稳定的保存物和接种物

为了控制脊髓灰质炎(以下简称脊灰)病毒引起的麻痹性疾病,三个血清型的Sabin减毒株已有效地用作口服活疫苗进行免疫接种。然而由于脊灰病毒基因组为单链RNA,复制时其突变率较双链DNA高,使活疫苗难以保持减毒这一表型特征,给世界性根除此病带来困难。作者将Ⅰ型Sabin株完整cDNA与质粒pBR325重组,用感染性cDNA克隆转染HeLa S3细胞和非洲绿猴肾(AGMK)细胞,回收的脊灰病毒分别称为PV1(Sab)IC-O(H)和PV1(Sab)IC-O(A)。作者测定了这两株病毒的温度敏感性(rct特征)、蚀斑大小     

Ⅰ型和Ⅱ型脊髓灰质炎减毒活疫苗的猴体神经毒力

[Marsden SA et al:J Biol Stand8(4):303,1980(英文)] 猴体神经毒力试验对脊髓灰质炎减毒活疫苗来说,仍然是一项重要的检定项目。Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎减毒活疫苗使用历史表明,它的猴体神经毒力随病毒株在细胞培养中传代水平而增高。为了确定Sabin株Ⅰ、     

Sabin3型脊髓灰质炎病毒株在细胞培养中的微进化及其对OPV质控的影响

为分析目前广泛使用的3型脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗(OPV)株的基因突变趋势,作者使用了一种灵敏的检测方法:即利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶裂解分析突变(MAPREC)的方法。分析对象为多个批号的商品Sabin3型活疫苗,分别来自原代病毒株(SO)和RNA蚀斑纯化的病毒株(RSO)。细胞基质分别是原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞和Vero细胞。当这些毒株在细胞中传10代后,利用上述方法可检出14个新的突变,其中9个可在一种以上培养条件下出现,另5个只在一种培养条件下出现。3956核苷酸位点上的A→G、5788位点上的T→C和6979位点上的T→C突变仅见于     

RT-PCR-RFLP方法用于脊髓灰质炎病毒型内鉴定

目的：采用逆转录-聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(RT—PCR—RFLP)方法对脊髓灰质炎(脊灰)病毒(pv)进行型内鉴定。方法：采用RT—PCR方法对PV的VP1区进行扩增，PCR产物分别用DdeⅠ、HpaⅡ、HaeⅢ3种限制性内切酶做RFLP分析，并与PV SabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ3个型别疫苗株相对照判定其是否为疫苗相关株。结果：对天津市2001年～2002年分离到的9株PV阳性株进行RT-PCR-RFLP试验，全部为疫苗相关株。结论：该方法应用于PV检测，可以尽早发现脊灰野病毒、疫苗衍生株及疫苗重组株等，便于尽快采取措施阻断其传播。     

脊髓灰质炎病毒型内鉴别及毒力分析的新方法

脊髓灰质炎(下称脊灰)的实验室诊断是世界卫生组织(WHO)关于全球消灭脊灰活动的重要部分.最近建立了临床标本中脊灰病毒检测、型内鉴定,脊灰病毒神经毒力分析及脊灰抗体检测的新方法.本文对脊灰病毒型内鉴定及神经毒力分析的新方法作一介绍。     

脊髓灰质炎病毒型内鉴别及毒力分析的新方法

脊髓灰质炎（下称脊灰）的实验室诊断是世界卫生组织（ＷＨＯ）关于全球消灭脊灰活动的重要部分。最近建立了临床标本中脊灰病毒检测、型内鉴定，脊灰病毒神经毒力分析及脊灰抗体检测的新方法。本文对脊灰病毒型内鉴定及神经毒力分析的新方法作一介绍。     

WHO合作研究验证转基因小鼠替代猴子用于脊髓灰质炎减毒活疫苗的神经毒力试验

神经毒力试验( NVT)是口服脊髓灰质炎疫苗( OPV)生产中的关键试验,按世界卫生组织( WHO)规程每个单价批OPV都要进行该项检测。由于猴子是脊髓灰质炎(脊灰)病毒的天然宿主,故至今NVT仍是在猴体上完成。1 990～1 991年WHO支持的两个实验室建立了携带人脊灰病毒受体的转基因小鼠。1 992年WHO推荐用不同毒力的3型脊灰病毒对转基因小鼠Tg PVR和猴子作敏感性比较试验,结果转基因小鼠可以区别OPV和高神经毒力制备物。1 993年日本实验动物中心研究所( CIEA)成功地将实验室规模的转基因小鼠Tg PVR2 1开发为能大量供应的标准实验动物,…     

美国口服脊髓灰质炎疫苗:Sabin 3型疫苗病毒经肠道繁殖后的分子生物学特征

由于发达国家野毒株引起的脊髓灰质炎基本消灭,故人们的兴趣趋向该疫苗的遗传稳定性研究。作者选择8名2月龄婴儿,服用由猴肾细胞生产的Sabin三价活疫苗。然后采用指纹图谱、序列分析及猴体神经毒力试验对从粪便分离的3型病毒,着重研究了RNA5′端非编码区与减毒表型相关的472位核苷酸的突变。服苗后2天内全部标本均分离出3型病毒,个别于服后10小时即检出病毒。然而排毒持续时间不尽相同,短至1周,长达5周以上。许多资料表明,服苗者排出的3型病毒RNA5′端非编码区472位核苷酸突变与毒力     

甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

 目的  验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法  用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1) ℃ 环境进行灭活,同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组,按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响,取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组,同时设置Hep-2细胞为对照组,每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数,并比较分析结果。结果  实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势,在灭活到第4天起,3个型别样品均检测不到病毒滴度;对照组病毒滴度在每毫升9.1～10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内,符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用,在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡;对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层,活细胞组t值为18.098,总细胞组t值为4.005,P值均＜0.05,差异有统计学意义。结论  脊灰病毒在第4天能被彻底灭活,在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响,避免结果出现假病变现象,确保结果的准确性;应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。     

arildone对福尔马林灭活的脊髓灰质炎病毒免疫原性的影响

为避免脊髓灰质炎活疫苗引起的麻痹型脊髓灰质炎,免疫缺陷或接受免疫抑制剂治疗的儿童最好使用灭活疫苗。作者研究了抗病毒剂arildone(4-6-2-氯-4-甲氧苯酚己基-3,5-庚二酮)在福尔马林处理过程中,对Sabin株和毒力株D抗原的稳定作用和对Sabin株免疫原性的增强作用。作者采用凝胶扩散试验和等密度离心法测定Sabin株和有毒株的D抗原含量。用豚鼠测定灭活病毒的免疫原性效力,结果以抗原消失限定值(AELV)表示。将Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒Sabin株以及毒力株(I型Mahoney和Brunhilde株,Ⅱ型MEF-1和LB株,     

通过在基因组5′端非编码区顺序中引入缺失构建低神经毒力脊髓灰质炎病毒

降低病毒复制中某些关键步骤的效率可能引起病毒减毒,作者用病毒株传染性cDNA克隆,在Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的Mahoney和Sabin株的基因组的5'端非编码区742个核苷酸长的顺序中引入缺失,从而在体外构建低神经毒力脊髓灰质炎病毒株.     

无小鼠神经毒力的乙型脑炎病毒/登革病毒1型嵌合病毒的筛选与序列分析

目的  采用蚀斑纯化法筛选对小鼠无神经毒力的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）/登革病毒（dengue virus,DENV）1型嵌合病毒（JD1）纯化株,分析影响JD1小鼠神经毒力的相关位点。方法  将JD1在乳地鼠肾细胞中进行3轮蚀斑纯化,检测JD1纯化株对小鼠的脑内神经毒力。然后提取无神经毒力纯化株的基因组RNA,用逆转录PCR分段扩增全基因组序列并进行序列测定。将测序结果分别与原DENV-1 的前膜-包膜蛋白和JEV骨架病毒株SA-14-14-2的基因序列进行比对。选取2个无神经毒力纯化株进行小鼠免疫保护实验。采用单侧t检验对结果进行比较。结果  经过3轮蚀斑纯化后,获得大、中、小3种蚀斑形态的6个JD1纯化株。3个纯化株对小鼠无神经毒力,小鼠脑内注射后全部存活;1株神经毒力较弱,70%以上小鼠存活;2株具有强神经毒力,小鼠全部死亡。测序结果显示,对小鼠无神经毒力的3个纯化株存在2处相同的氨基酸突变。将其中2个纯化株JD1-PP-61和JD1-PP-31腹腔免疫小鼠后,再用1 000半数致死量DENV-1鼠脑适应株进行脑内攻击。JD1-PP-61能较好地保护小鼠抵抗病毒攻击,仅20.0%小鼠死亡（t=7.237,P<0.001）;JD1-PP-31保护效果稍弱,41.9 %小鼠死亡（t=4.752,P<0.01）。结论  通过蚀斑纯化筛选出对小鼠无神经毒力的JD1纯化株,并发现了可能与神经毒力减弱相关的位点。     

乙型脑炎病毒E315回复突变对小鼠神经毒力的影响

目的  构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 囊膜蛋白第315位氨基酸（E315）回复突变株,并分析该位点回复突变后在小鼠体内的神经毒力变化。方法  采用重叠PCR扩增含基因组第1921核苷酸位点回复突变的基因片段,替换SA14-14-2全长克隆的相应区域,获得回复突变株M315。通过测定突变株的蚀斑大小和一步生长曲线并与SA14-14-2进行比较,分析M315的增殖特征;采用小鼠模型测定该突变株的脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力和乳鼠传代返祖,分析疫苗株E315位点回复突变后毒力的变化。结果  成功构建了回复突变株M315,其蚀斑大小和增殖特征与疫苗株相似。M315对17~19日龄小鼠无皮下或腹腔入脑神经毒力,鼠脑病毒有很低但可检测的脑内神经毒力（小于3.0 lg蚀斑形成单位（plaque forming unit,PFU） / 0.03 ml）,皮下注射不发病。3~5日龄乳鼠脑内接种后发病,但脑内病毒毒力低于3.0 lgPFU / 0.03 ml。结论  在分子水平上证明了E315位点是影响乙型脑炎疫苗安全性的关键位点之一,但影响较弱。E315位点的回复突变虽使SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力和乳鼠传代返祖能力增强,但没有超出中国药典规定的毒力范围。     

SabinⅢ型脊髓灰质炎活疫苗的猴体神经毒力比较

1974年到1978年期间,英国国立生物学标准与检定研究所在检定SabinⅢ型脊髓灰质炎活疫苗过程中,发现有几批疫苗在爪哇猴脊髓注射组中的神经毒力比同源参考毒株为高。为证实1961年以来Ⅲ型疫苗的神经毒力是否发生了改变,作者对该所检定过的所     

脊髓灰质炎病毒抗原嵌合体可作为一种新疫苗

目前使用的脊髓灰质炎减毒活疫苗由野型病毒在非人灵长类动物和组织培养中经多次传代而得。有证据表明,1型疫苗与亲代野毒株相比,有多处减毒突变;而3型病毒仅有两处突变。在发达国家2和3型Sabin疫苗株与接种者的少数脊髓灰质炎有关。脊髓灰质炎病毒分子生物学和遗传学的最新进展提示有可能制备新的、与1型病毒同样安全的2和3型疫苗。作者将含1型Sabin疫苗抗原位点1的1174个硷基对的PstⅠ限制性内切酶片段亚克隆到噬菌体M13 mp18中。用3型3.370株抗原位点1区的8个氨基酸取     

Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗的制备及免疫原性评价

目的  建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine, IPV）生产工艺并评价其免疫原性。方法  采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒,制备3价Sabin株IPV（Sabin strain IPV, sIPV）。通过ELISA检测D抗原含量。检测病毒滴度,电子显微镜下观察纯化病毒形态并电泳鉴定,分析抗原纯度,同时检测纯化原液宿主细胞残余DNA和蛋白含量。通过大鼠体内接种法比较sIPV和野生株IPV免疫原性,并观察中和抗体滴度变化。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型收获液D抗原含量分别为2 437、365、1 253 DU/ml,病毒滴度分别为每毫升8.4 、7.8和7.9 lg半数细胞培养物感染量。纯化病毒抗原纯度均﹥99%。电子显微镜下观察可见直径20~30 nm病毒颗粒,电泳鉴定正确。纯化原液的残余宿主细胞DNA和蛋白含量分别12.3 pg/500 μl和9.8 ng/ml。sIPV 3针免疫后在大鼠体内诱导产生抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体的几何平均滴度分别为9 397.8、554.7和4 668.4,与野生株IPV相比Ⅰ型明显增高（t=-3.429,P=0.004）,Ⅱ、Ⅲ型无明显差别,初免后19周内均维持在较高水平。结论 建立了稳定的sIPV生产工艺,制备的sIPV免疫原性较好。