基于非线性化学指纹图谱技术快速鉴别两面针根、茎及伪品飞龙掌血

目的建立两面针的非线性化学指纹图谱,区分两面针根、茎及伪品飞龙掌血。方法采用硫酸-丙酮-硫酸锰-溴酸钠稳态体系,通过正交实验优化实验条件,寻找两面针根、茎及伪品飞龙掌血差异性大的非线性化学指纹图谱。结果获得了稳定性、重复性较高的两面针根、茎及伪品飞龙掌血的指纹图谱,三者差异性较大,可定性鉴别两面针根、茎及伪品飞龙掌血。结论非线性化学指纹图谱技术适用于两面针药材及其混伪品的快速鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;同时为非线性化学指纹图谱技术应用于其他易混中药材的鉴定提供示范。     

基于酶促恒温扩增技术快速鉴别天麻真伪检测方法的建立与应用

目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组DNA的灵敏度为1 pg·μL^-1,比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。     

雷公藤药材基原考证及分子鉴定研究

目的 为确保雷公藤药材临床用药的安全性和有效性,对雷公藤药材基原进行文献考证,并建立特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法.方法 查阅文献对雷公藤基原进行考证;对雷公藤及混伪品DNA条形码进行对比分析,筛选具有稳定差异的特异性鉴别位点,设计鉴别引物,优选出特异性快速PCR扩增条件.结果 文献考证发现雷公藤和昆明...     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别

目的设计出齿瓣石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能完成对齿瓣石斛真伪进行准确鉴别。方法根据齿瓣石斛及其他枫斗类、黄草类石斛的rDNA ITS序列数据库,设计了齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别引物JB-Chiban-01S和JB-Chiban-01X。然后,对38种石斛属植物模板DNA进行了PCR扩增,阳性者即为齿瓣石斛正品。结果当退火温度设定为58℃时,只有齿瓣石斛的模板DNA能被扩增出来,而其他的37种石斛属植物均为阴性。该鉴别反应重复性好,已在鉴别齿瓣石斛时发挥重要作用。结论运用位点特异性鉴别引物能成功地对齿瓣石斛进行PCR鉴别,与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有高效、准确、简便、省时等优点。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

基于DNA条形码和特异性PCR技术鉴别蚂蟥及其常见伪品

目的：建立蚂蟥特异性PCR鉴别方法,能够快速准确地鉴别蚂蟥与其常见伪品。方法：通过分析蚂蟥与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列,寻找蚂蟥SNP变异位点,设计特异性引物;通过对退火温度、循环次数、DNA模板量及Taq酶等关键因素的考察,确立最优反应体系及条件,并将特异性PCR方法应用到水蛭（蚂蟥）粉末中进行药材粉末的基原鉴别,同时为保证试验结果的准确性,将PCR扩增产物进行一代测序。结果：特异性PCR结果表明蚂蟥在400～600 bp有单一明亮条带,常见混伪品则无此条带,试验结果与一代测序结果一致,为蚂蟥。结论：该方法能够将蚂蟥与其常见伪品菲牛蛭、东北小水蛭、黑条、小黑条等区别,且能鉴别水蛭（蚂蟥）粉的基原,为提升中药监管力度,打击中药掺伪行为提供了强有力的技术支持。     

飞龙掌血乙酸乙酯部位化学成分研究

目的:研究飞龙掌血乙酸乙酯部位的化学成分.方法:采用薄层色谱、硅胶及凝胶柱色谱法对飞龙掌血乙酸乙酯部位进行分离纯化,通过理化方法和波谱数据进行结构鉴定.结果:从飞龙掌血的乙酸乙酯部位中分离得到7个化合物,通过波谱数据及理化性质分别鉴定为茵芋碱(1)、γ-花椒碱(2)、白屈菜红碱(3)、二氢白屈菜红碱(4)、异茴芹内酯(5)、去甲布拉易林(6)和氧化两面针碱(7).结论:化合物6为首次从该植物中分离得到.     

基于rDNA ITS序列SNP位点的特异性聚合酶链反应引物鉴别青椒和花椒

目的设计专用于花椒与青椒鉴别的特异性聚合酶链反应(PCR)引物,建立花椒与青椒的分子鉴别方法。方法本研究提取花椒与青椒样品的DNA,并利用rDNA ITS(核糖体DNA内部转录间隔区)序列通用型引物分别对样品进行PCR扩增,PCR产物经双向测序、比对,寻找单核苷酸多态性(SNP)特异性位点,并分别针对花椒与青椒的SNP位点设计出花椒与青椒的特异性PCR引物,用于花椒与青椒的特异性PCR引物鉴别。结果所设计的特异性引物为花椒和青椒的鉴别提供了分子鉴定的依据,可以快速、准确地检测出花椒和青椒。结论本文所设计的特异性PCR引物能有效地鉴别出花椒与青椒,该方法具有准确、高效、灵敏、简便等特点,具有较好的市场应用前景。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

RNaseH依赖性PCR扩增结合熔解曲线法鉴别石菖蒲与藏菖蒲掺杂

目的 采用核糖核酸酶H依赖性PCR(rhPCR)扩增结合熔解曲线分析对石菖蒲与藏菖蒲进行快速鉴定及相互掺杂检测。方法 比对分析石菖蒲与藏菖蒲核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列，寻找稳定的单核苷酸多态性(SNP)位点设计特异性扩增引物，根据扩增产物熔解温度(T_m)不同进行鉴别，考察引物特异性，筛选最佳混合引物比例，并考察该方法灵敏度、掺混检出限及适用性。结果 设计的特异性引物具有良好特异性，石菖蒲、藏菖蒲扩增产物可分别产生(89.4±0.2)与(87.9±0.2)℃的单一特异性熔解曲线峰。所建立的方法灵敏度高，DNA检出限均为0.1 ng,对石菖蒲和藏菖蒲的掺混检出限均为10%。检测样品28份，其中石菖蒲16份、藏菖蒲12份，检测结果与DNA条形码结果一致。结论 该研究基于RNase H依赖性PCR扩增结合熔解曲线建立的石菖蒲及藏菖蒲鉴别及掺杂检测方法可有效鉴别石菖蒲、藏菖蒲及掺杂样品，有利于石菖蒲药材质量控制。     

基于巢式PCR的紫草鉴别引物筛选

目的:基于巢式聚合酶链式反应(PCR)理念设计并筛选出可用于高效扩增与鉴别紫草市场样品真伪的特异性引物。方法:针对新疆紫草的ITS序列和紫草非《中华人民共和国药典》品ITS2序列,利用Primer Premier 5软件进行巢式引物设计;比较ITS2通用引物PCR和巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳检测;基于扩增产物片段长度、变异位点覆盖情况对设计的紫草药材特异性引物进行评价。结果:经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出11对引物进行合成;巢式PCR对紫草药材基因组DNA的扩增效率明显优于ITS2通用引物PCR;基于巢式引物直接扩增紫草基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测的结果明显优于ITS2引物直接扩增紫草基因组DNA,且呈单一条带;确定AE-9S/AE-2A、AE-4S/AE-10A、AE-12S/10A、AE-29S/AE-29A共4对引物适用于紫草正伪品鉴定。结论:在DNA条形码鉴定和巢式PCR技术的基础上,确定了4对可以用于有效区分药材市场中主流的新疆紫草和紫草非《中华人民共和国药典》品的特异性...     

麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的PCR-RFLP鉴别方法研究

目的:通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP法)建立一种能快速鉴别麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的方法。方法:对麦冬和山麦冬的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对，选择山麦冬的特异性酶切位点PmlI,设计PCR-RFLP反应引物。以退火温度58℃、循环数为30,LR-F和LR-R鉴别引物(10μmol·L^-1)各0.5μL,PmlI限制性内切酶在37℃酶切2 h的反应条件为PCR-RFLP法的参数，并进行方法学考察和统计分析。结果:在退火温度58℃、循环数为30时，山麦冬或掺有山麦冬的麦冬样品经过特异性引物扩增后，能被PmlI限制性内切酶酶切，在100～250 bp之间检出2条单一DNA条带，麦冬样品则无此条带。该方法稳定性好，专属性强，能对麦冬与山麦冬饮片及掺混样品进行鉴别，并对麦冬中掺入山麦冬的检出限为5%。结论:建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好，灵敏度高，实现了麦冬与山麦冬饮片及麦冬中掺混山麦冬的快速检测，可用于麦冬与山麦冬药材真伪鉴别的补充检验方法。     

基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭

目的：通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果：通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论：通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。     

飞龙掌血茎的化学成分研究

目的研究飞龙掌血茎的化学成分。方法采用硅胶柱色谱、制备高效液相色谱及反复重结晶等方法进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定。结果从飞龙掌血茎的乙酸乙酯部位中分离并鉴定了7个化合物,分别为:飞龙掌血素(1),飞龙掌血双香豆素(2),8′-(2′,3′-二羟基-3′-甲丁基)-5,7-二甲氧基香豆素(3),飞龙掌血新双香豆素(4),白屈菜红碱(5),橙皮素(6)和橙皮苷(7)。结论化合物1～7均为首次从飞龙掌血茎中分离得到,其中化合物6为首次从飞龙掌血属植物中分离得到。     

基于Cytb基因对药用昆虫地鳖虫炮制品的分子鉴别研究

目的:建立基于线粒体DNA细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的分子标记技术对地鳖虫(地鳖、冀地鳖)及其混伪品炮制药材进行分子鉴定的方法。方法:采用改良的饱和氯化钠法对地鳖虫及其混伪品炮制药材的总DNA进行提取。通过通用引物REVCB2H、REVCBJ对所有样品的Cytb基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增;用MEGA 5.1软件对所有样品的Cytb基因序列采用邻接(NJ)法构建系统发育树;并利用DNAMAN软件对得到的所有样品的Cytb基因序列进行比对,分析正品、混淆品间序列差异,在差异较大区域设计特异性引物Esin-F和Esin-R进行分子鉴定。结果:以提取的DNA为模板均能成功扩增出相应的Cytb基因片段;构建的系统发育树与其亲缘关系一致;设计的特异性引物Esin-F和Esin-R在同样的条件下,只有地鳖虫得到了扩增条带。结论:建立了地鳖虫及其混伪品药材炮制品的DNA提取方法;设计的特异性引物对地鳖虫有高度的特异性,能够有效鉴别地鳖虫及其混伪品。     

冬虫夏草的分子鉴定方法

目的 建立专属性强的冬虫夏草分子鉴定方法.方法 通过在ITS1区设计冬虫夏草的特异性引物,并进行不同条件的优化试验,建立冬虫夏草的酶联免疫吸附法(PCR)鉴别体系.结果 建立的酶联免疫吸附法(PCR)体系对冬虫夏草有164bp条带的扩增,而伪品无扩增现象.结论 所建立的PCR体系能够准确、快速的鉴别冬虫夏草及其伪品.     

市售覆盆子药材DNA条形码鉴定研究

目的基于ITS2条形码序列检测市场销售覆盆子药材,为保证覆盆子药材使用的正确性和安全性提供一种新的鉴定手段。方法获取掌叶覆盆子及其5种常见同属易混种ITS2序列,以及GenBank上下载的共计48条序列。使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度,GC含量和变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA 7.0软件计算遗传距离和构建邻接系统发育聚类树。同时随机检测24份市售覆盆子药材,利用中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。结果掌叶覆盆子基原植物可与其同属易混种进行明显区分;市售药材中正品22份,伪品1份,混合物1份。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术能够成功鉴定市场销售的掌叶覆盆子及其混伪品。     

基于Cyt b基因的PCR技术对牛鞭药材的鉴定方法研究

目的:建立对牛鞭药材的聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,从分子水平上对牛鞭药材的真伪进行鉴定。方法:提取牛鞭及其伪品(驴鞭、猪鞭、羊鞭)的基因组DNA,并对其完整性、纯度和浓度进行检测。利用GenBank相关信息,以牛鞭的线粒体细胞色素b基因(Cyt b)为靶基因,应用Primer-BLAST在线软件设计特异性引物,并对不同物种鞭类样品进行PCR扩增,对产物进行电泳分析;对获得的牛鞭样本PCR产物进行克隆和DNA测序验证。对所建立的PCR鉴定方法进行特异性和重复性考察验证。结果:提取所得的牛鞭及其伪品DNA的纯度较高,无蛋白质或RNA污染;1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示,牛鞭样本在200～300 bp之间均出现明显的目的基因条带,而其他伪品未见相应条带出现。DNA测序结果证实,所获牛鞭样本基因片段的核苷酸序列与GeneBank中牛鞭物种相似性均为100%。方法学验证结果显示所建方法特异性、重复性均良好。结论:本研究所建基于Cyt b基因的PCR鉴定方法简单、快速,准确性、特异性、重复性均良好,可满足牛鞭及其伪品的分析鉴定需求。