遗传工程在产抗生素链霉菌方面的研究进展

对链霉菌遗传工程中的载体——受体系统、抗生素抗性基因的克隆、抗生素生物合成结构基因的克隆、调节和分化基因的克隆、杂合抗生素的产生以及链霉菌作为外源基因克隆的受体等几个方面的研究报道作了综述。     

抗生素产生菌基因克隆的新进展

虽然顶头孢的转化作用已经得到证明,然而抗生素产生菌的基因克隆技术基本上仍局限于链霉菌属。有关克隆链霉菌基因的许多基础研究已有评述,并且出版了天蓝色链霉菌和变青链霉菌分子生物学技术的实验手册。最新进展还包括原生质体形成、再生和融合。目前,原生质体再生是在铺有渗透稳定培养基的琼脂培养皿上完成的。尽管在液体中有利于原生质体再生,但至今并未实行。     

金霉素链霉菌作为影响抗生素产量基因克隆的宿主

四环素(TC)和金霉素(CTC)产生菌金霉素链霉菌是重要的工业微生物,具有不同生产特性的金霉素链霉菌突变株可以作为四环素类抗生素生物合成基因克隆的宿主,也可用于以产生杂合抗生素为目标的实验,参与抗生素生物合成及抗性基因已在几株链霉菌中克隆。     

遗传工程产生的“杂种”抗生素

链霉菌分子克隆系统方面的最近进展,已有可能对该属细菌部分成员产生的某些抗生素生物合成基因进行分离,这种克隆现在能用来检验通过产生不同抗生素的链霉菌之间生物合成基因的转移可以产生新抗生素的理论。能否产生“杂种”抗生素必然取决于生物合成酶的底物特异性。关于这些方面了解很少。为要证明杂种抗生素的产生,我们开     

文摘

13-40绿色产色链霉菌的Bialaphos生物合成基因:克隆、种间表达以及与吸水链霉菌合成基因的比较绿色产色链霉菌和吸水链霉菌是从世界上不同地区分离到的,在分类学上属于不同类群,但两者产生同一种抗生素Bialaphos。在变青链霉菌中克隆绿色产色链霉菌的Bialaphos抗性基因bar.以此做选择标记分离Bialaphos产生基因。实验证实克隆到的bar     

几种调控基因对除虫链霉菌工业生产株的抗生素效价的影响

在模式链霉菌（如天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌）中导入许多抗生索生物合成的调控基因可以大幅度提高抗生索的含量。本文报道利用链霉菌的整合质粒克隆几种已知的调控基因。并通过接合转移从大肠埃希菌中导入产生avermectin和多拉菌素的除虫链霉菌工业生产菌株中。发现3种调控基因afiR、aveR和orfX对菌株MMR630中avermectin的含量均可以提高约1倍。但是，以上的3种，加上另外3种调控基因分别导入菌株G11后，发现除aft8提高约13％外，其余调控基因使菌株产生多拉菌素的含量反而有不同程度的降低。将调控基因币B置于链霉菌强启动子PerrnE^＊下表达降低了菌株G11中多拉菌素的含量。上述结果表明，调控基因对不同链霉菌的抗生素生物合成具有不同的影响，反映了抗生素生物合成确实受到了复杂网络的调控。     

卡里霉素产生菌的卡那霉素抗性基因表达

天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因成功的分子克隆以及它们异种宿主的表达促进了成功克隆其它抗生素生物合成的基因。一种抗生素生物合成所需基因多半同相同抗生素的抗性编码基因和在抗生素合成调控中的基因密切联系。红霉素生物合成基因的克隆就是以这种抗性基因作为工具而取得进展的。我们感兴趣的是簇集生物合成基因表达的控制机制,以及作为生物合成基因是如何调控这些抗性基因的表达的。解决这些问题会有助于链霉菌次级代谢调控和差别的了解。本文阐述被克隆的卡那霉素抗性基因(Kmr)的特征及其在卡那霉素产生菌内的转录调控作用。卡那霉素抗性机制曾报道,变铅青链霉菌1326隐含克隆卡那霉素链霉菌Kmr基因的pMCP5质粒,该     

杂合抗生素—新基因重组的贡献

在链霉菌中已克隆了编码抗生素生物合成全部途径中所涉及的基因。通常两种生物合成是在不同的菌种中进行的,抗生素生物合成基因的种内克隆使两个生物合成途径在同一细胞中表达成为可能。结果导致形成了与它们的亲株所产生的抗生素结构不同的新的杂合抗生素。     

链霉菌的大型线性质粒和抗生素产生

虽然人们认为质粒参与链霉菌产生抗生素的遗传控制,但除了紫红链霉菌SANK95570的pSV1外,尚未检测到含有结构基因和/或调节基因的质粒。特别是天蓝色链霉菌A3(2)的SCP1质粒,通过遗传和克隆的研究揭示次甲基霉素生物合成(mmy)及其抗性(mmr)基因在SCP1上形成一个至少有17kb的基因簇,从而证明它控制着次甲基霉素产生。尽管有这些累积的资料,还是没有检测到SCP1本身。一个被普遍接受的想法是这个共价闭环(CCC)DNA质粒可能太大,以至于不能将它以其完整形式分离出来。没有考虑到会牵涉到大型线性DNA质粒的问     

链霉菌抗生素生物合成的基因调控

链霉菌中抗生素生物合成受到许多调控基因的调控,它们通过途径特异性调控方式、全局性调控以及双组分调控方式对基因表达进行调控.概述这些调控基因将有利于改良抗生素生产菌株及新型抗生素的研究,并为改造链霉菌抗生素生物合成相关基因、提高产量提供理论依据.本文归纳了国内外链霉菌抗生素生物合成基因簇各调控基因及其研究进展.     

采用基因工程技术提高链霉菌抗生素产量的进一步设想

自首次报道运用链霉菌宿主-载体系统克隆抗生素合成基因以来,六年中,许多工业和科学研究实验室通过各种途径运用该技术已有了很大进展,至少22种不同种类抗生素的生物合成基因已经克隆(表一)。虽然这些基因作为基础研究很有意义,然而企业     

文摘

16-81 浅绛红链霉菌基因在加利利链霉菌中克隆产生新蒽环类抗生素 浅绛红链霉菌ATCC 25489中,一个紧邻与含蒽环类聚酮体合成酶部分的探针杂交区域的DNA片段克隆到加利利链霉菌ATCC 31615中,杂合菌株产生了新蒽环类抗生素,当用此片段进行亚克隆时,宿主除了     

链霉菌启动子的克隆和抗生素的产生

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自金霉素链霉菌UK81的启动子,得到了三个转化子。其中转化子变青链霉菌TK24(pTA1)是含高活性外源启动子的重组子。而变青链霉菌TK24(pTA5)和变青链霉菌TK24(pTA7)中的外源启动子活性很低,但变青链霉菌TK24(pTA7)产生了新抗生素。其抗菌谱与供体金霉素链霉菌UK81的不同,当重组质粒,pTA7再转化金霉素链霉菌UK81时,得到的再转化子的抗菌谱仍与金霉素链霉菌UK81相同,但再转化子的抗生素产生被促进。经高压电泳和薄层层析表明,变青链霉菌TK24(pTA7)产生的胞内抗生物质为两种成份。金霉素链霉菌UK81(pTA7)和金霉素链霉菌UK81产生的抗生素成份相同而与变青链霉菌TK24(pTA7)产生的不同。实验得到的三个重组质粒pTA1、pTA5和pTA7上的插入片段大小分别为2.7kb、3.75kb和2.2kb。     

链霉菌抗生素生物合成基因的克隆和分析

最近几年,直接将基因克隆到链霉菌寄主中的质粒载体和噬菌体载体的开发取得了相当快的进展。用这些载体分离获得的基因包括抗生素抗性基因(绝大多数是由产生相应抗生素的菌株中克隆得到),初级代谢方面的基因(甘油或葡萄糖利用及氨基酸或核糖体 RNA 生物合成),各种输出酶基因(酪氨酸酶、琼脂水解酶、β-内酰胺酶,α-淀粉酶),     

通过灰色链霉菌原生质体再生提高卡那霉素抗性的机制——Ⅰ.指导高水平氨基糖苷3-N-乙酰转移酶活性基因片段的克隆

由于链霉基因技术的发展,使我们能够克隆和分析结构以及抗生素生物合成基因与抗性基因的调节,相继发现了一些簇集在一起的抗生素生物合成基因和抗性基因。并且证实了一些基因的启动区和二种形式的RNA聚合酶全酶。在分别丧失生产链霉素(SM)和Istamycin(IS)能量的灰色链霉菌和S.tenjimariensis两个突变株之间进行的种间原生质体融合而产生抗生素抗性的研究过程中,Yama Shita等发现灰色链霉菌原生质体再生的结果出现了显著增强卡那链霉(KM)抗性的克隆。没有经过原生质体再生的灰色链霉菌对5μg/mlKM敏感,抗性克隆后可在500～1000μg/ml KM的情况下生长。尽管人们知道链霉菌原生质体再生可引起各种各样的表     

基因克隆产生杂合蒽环类抗生素研究进展

随着人们对芳香聚酮体的生物合成机理的深入了解，将有越来越多的Ⅱ型PKS基因和DOS基因被克隆。人们有可能应用基因克隆或组合生物合成方法对现有抗生素进行改造或创造出结构新颖的杂合化合物。主要介绍了应用基因克隆的方法产生的杂合蒽环类抗生素的研究进展，同时还介绍了蒽环类抗生素的生物合成，链霉菌基因克隆策略与组合生物合成，以及杂合蒽环类抗生素及其前体等研究进展。     

链霉菌抗生素生物合成基因的克隆策略

链霉菌具有许多不同于其它原核生物(如大肠杆菌等)的生物学特性,它们在生长过程中常伴有营养菌丝、气生菌丝和顶端结成孢子等形态分化类似霉菌的特性。链霉菌含有一个单环染色体,其基因组大小约10~4kb(近似大肠杆菌的3倍),在DNA组成中G+C含量高达70mol%以上,接近自然界中所观察到的上限。这些生物学上的差异使得链霉菌不能用其它遗传上了解得很清楚的原核系统进行研究,而必须自成研究体系。近年来,链霉菌自身的质粒和噬菌体载体系统的开发进展迅速。利用这些体系统已经分离获得了包括抗生素抗性基因、初级代谢方面的基因、各种输出酶基因、形态分化基因以及许多抗生素(如红霉素、四环素、放线紫红     

硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建

以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整，并为进一步研究硫霉素产生菌卡特利链霉菌Ａ５２０中抗生素生物合成基因打下了良好基础     

链霉菌的次级代谢调节

链霉菌的次级代谢受到种类繁多的小分子量物质和调节蛋白的调控。我们将叙述:1)在天蓝色链霉菌A3(2)中能增强afsB基因对放线紫红素产量起正效应的afsC基因;2)A因子,这是在灰色链霉菌中把次级代谢与细胞分化相联的“微生物激素”;3)在暗黄绿链霉菌(S.fulvoviridis)克隆的碳青霉烯生物合成基因簇中,控制碳青霉烯生产和孢子形成的基因鉴定。天蓝色链霉菌A3(2)中afsB和afsC基因天蓝包链霉菌A3(2)的afsB基因是一个多向性的调节基因,是菌体生物合成A因子(2-异辛酸-3R-羟甲基-γ-丁内酯)、呈色的抗生素放线紫红素(actinorhodin)和十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)所必需     

质粒间重组后弗氏链霉菌的新霉素磷酸转移酶基因在大肠杆菌内的表达

体外重组和分子克隆的技术促进了一种微生物的基因在另一个种系发生的远缘种内表达的研究。例如,已证实不同的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和环状芽孢杆菌)的基因在大肠杆菌内表达。已构建能在链霉菌和大肠杆菌中复制的双功能复制子;链霉菌DNA