金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性测定方法优化及初步应用

 目的  优化金黄色葡萄球菌α-毒素（α-toxin,AT）溶血活性测定方法,用于无毒突变AT（non-toxic mutant AT,mAT）特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。方法  使用AT裂解兔红细胞,释放血红蛋白,通过分光光度法检测溶血活性,并对该方法中的孵育时间、兔红细胞终浓度、Triton X-100浓度进行优化,同时验证方法重复性。对mAT特异性血清抗体进行体外功能性评价,绘制AT溶血曲线,计算AT 溶血率50% 时的浓度,检测血清半数中和抗体滴度。结果  AT溶血活性最适检测条件为：孵育时间90 min,兔红细胞终浓度为2%（V/V）,Triton X-100浓度为0.25%。此条件下,分别加入mAT和含mAT的多价抗原血清抗体,对AT溶血活性均起到明显的抑制作用。AT 溶血率50%时浓度为1.75 μg/ml,变异系数3.75%。mAT和含mAT的多价抗原血清抗体的半数中和抗体滴度初步结果均为1∶64。结论  优化的AT溶血活性检测方法重复性良好,且检测时间较短,可用于特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。     

重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的  在毕赤酵母细胞中稳定表达经连接肽连接的HBsAg和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白（glycoprotein,g）E的重组蛋白,并进行初步纯化及颗粒性验证。方法  构建HBsAg-gE的四拷贝重组表达质粒,经酶切线性化后电转化至毕赤酵母KM71细胞中,甲醇诱导表达。采用免疫印迹法和ELISA检测表达的重组蛋白,经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析初步纯化后进行透射电子显微镜观察。结果  HBsAg-gE四拷贝重组质粒经双酶切鉴定正确。表达的重组蛋白经免疫印迹法检测,可以与小鼠抗gE单克隆抗体及抗HBsAg多克隆抗体特异性结合,相对分子质量约90 000。经ELISA检测HBsAg呈阳性。蔗糖密度梯度离心后,重组蛋白聚集在40%至55%区带之间,在透射电子显微镜下观察到直径约20 nm左右的病毒样颗粒结构。结论  成功在毕赤酵母中表达了HBsAg-gE病毒样颗粒,为在酵母系统中表达水痘-带状疱疹重组疫苗奠定了基础。     

布鲁菌Tb噬菌体效价噬斑测定法的建立

 目的  建立标准化的布鲁菌Tb噬菌体效价噬斑测定方法。方法  通过比较单层琼脂平板法与双层琼脂平板法,对宿主菌接种浓度、吸附时间及培养时间等参数,标准化布鲁菌Tb噬菌体效价测定方法,并分析其精密性。结果  虽然两种方法测定的噬菌体结果无差别,但双层琼脂平板法的噬斑背景背景更清晰,易于结果观察。经优化后确定布鲁菌Tb噬菌体效价测定条件：宿主菌的最适接种浓度为1.0×10⁹ ml^-1,宿主菌与噬菌体混合后不需吸附,培养3~5 d后进行噬菌斑计数。建立的标准检测方法具有较好的精密性。结论  建立了布鲁菌Tb噬菌体效价噬菌斑测定方法,为布鲁菌Tb噬菌体及布鲁菌活疫苗质量控制奠定了基础。     

胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗2型糖尿病患者疗效的网状Meta分析

目的：系统评价胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗2型糖尿病的临床疗效。方法：根据PICOS原则制定检索策略,计算机检索MEDLINE、EMBASE、CENTRAL等数据库,检索时限从建库至2018年8月。严格按照纳入排除标准筛选随机双盲对照试验,提取纳入文献的基本信息和结局指标,采用Corchrane偏倚风险评估工具对文献进行方法学质量评价。采用软件STATA14.0对各效应指标进行网状Meta分析,连续性变量用均数差（MD）及95% CI计算,二分类变量用比值比（OR）及95% CI计算。结果：共纳入51篇英文研究,合计22 360例患者,涉及19个干预措施。网状Meta分析显示,在疗效方面,索马鲁肽1.0 mg降低糖化血红蛋白、提高HbA1c<7%达标率、降低空腹血糖、减轻体质量、降低收缩压最明显,艾塞那肽10 μg降低舒张压最明显。结论：胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗2型糖尿病有良好的疗效。     

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型，以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element，ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP，并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中，筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol，E₂)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察，同时考察模型的稳定性及时效量效关系，以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中，SEAP报告基因的表达受E₂的诱导并呈剂量与时间依赖关系，E₂对阳性克隆细胞无增殖作用，本模型的Z′因子值为0.7，免疫细胞化学染色结果表明，转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。     

Vero细胞洗换方式对轮状病毒活疫苗收获液的影响

目的  探讨Vero细胞洗换方式对口服六价轮状病毒活疫苗收获液的影响。方法  采用3种不同方式洗换Vero细胞后,观察相应的致细胞病变效应,使用ELISA检测洗换前后牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）残留、快速荧光灶法检测收获液病毒滴度,并测定病毒收获液浊度及粒径,比较3种洗换方式的差异。结果  使用方式1、2、3洗换后,方式1、2致细胞病变进程明显较方式3快;收获液BSA残留（均值±标准差）分别为（15.0±4.1）、（16.3±4.0）、（52.6±4.7） ng/ml,方式1、2较方式3收获液BSA残留明显下降;方式1、2、3洗换的收获液病毒滴度分别为（7.27±0.06）、（7.23±0.06）、（6.97±0.06） lg荧光灶单位/ml,方式1、2较方式3收获液病毒滴度明显上升。不同洗换方式处理后,病毒收获液浊度和粒径的差异无统计学意义。方式1、2、3处理后,病毒收获液BSA残留、病毒滴度、浊度与粒径均符合标准。结论  结合实际生产条件,滴度较高、BSA含量较低的方式1适合作为后续的大规模原液制备过程中的洗换方式。     

鞣云实素对果糖溶液喂养大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影响

目的果糖溶液喂养Wistar雄性大鼠,注射Wistar大鼠不同浓度的鞣云实素检测大鼠体内胰岛淀粉样多肽(IAPP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及胰岛素(INS)浓度的变化。方法 Wistar大鼠给予相同浓度果糖溶液连续灌胃3周,第4周腹腔注射不同浓度的鞣云实素溶液,隔1 d注射1次,连续注射3次,第7天取大鼠血清,利用酶标仪测定血清中胰岛淀粉样多肽、胰高血糖素样肽-1及胰岛素的浓度。结果果糖溶液喂养后胰岛素分泌减少、胰岛淀粉样多肽浓度降低、胰高血糖素样肽-1浓度升高;注射20 mg·kg-1鞣云实素溶液后胰岛素分泌增多、胰岛淀粉样多肽浓度明显降低、胰高血糖素样肽-1浓度明显增高;注射40 mg·kg-1鞣云实素溶液后胰岛素分泌与对照组相比明显减少、胰岛淀粉样多肽浓度明显增高且高于对照组、胰高血糖素样肽-1浓度明显降低。结论低浓度鞣云实素能够促进胰高血糖素样肽-1生成、刺激胰岛素分泌及抑制胰岛淀粉样多肽的形成,本实验为进一步研究鞣云实素对胰岛素抵抗大鼠模型的相关激素变化提供一定基础。     

抗柯萨奇病毒A组10型中和抗体检测用毒株的应用研究

目的 研究抗柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）中和抗体检测用毒株的应用。方法 对CV-A10毒株进行扩增培养,建立3级种子批并进行相关检定。采用3人3次独立测定病毒滴度,对工作种子批进行滴度标定,通过分别与肠道病毒71型（enterovirus A71,EV-A71）、CV-A16、CV-A6免疫血清进行交叉中和反应,评价该毒株的专属性。对CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清样品进行中和抗体效价检测,对其应用进行评价研究。结果 获得一株CV-A10中和抗体检测用毒株,3级种子批的无菌检查、支原体检查等项目均符合中国药典2020年版三部相关要求;经标定,平均病毒滴度为7.903 lg半数细胞培养物感染量（50% cell culture infectious dose,CCID₅₀）/ml（95%置信区间：7.868~7.937 lgCCID₅₀/ml）,变异系数为1.10%;与EV-A71、CV-A16、CV-A6免疫血清无交叉反应,专属性良好;检测CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清,中和抗体的最大值与最小值倍数差均小于4,中和抗体检测变异系数分别为6.38%和3.64%。结论 抗CV-A10中和抗体检测用毒株具有较好的专属性可很好的应用于后续抗CV-A10中和抗体的相关检测。     

利拉鲁肽的药理及临床研究进展

 利拉鲁肽是一种酰化胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物,通过激活GLP-1受体,以葡萄糖依赖性刺激胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌,临床用于2型糖尿病的二线治疗,可与其他口服降糖药联合使用,但不用于1型糖尿病的治疗。文中通过Medline对利拉鲁肽进行文献检索,并对其药理作用、药动学、临床研究、安全性和药物相互作用等进行综述。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的  验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR（quantitative PCR,qPCR）检测法。方法  用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR法检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果  qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.003 0~300.000 pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.003 0 pg/μl;精密度良好（相对标准偏差＜15%）;反应体系配制好后置于2~8 ℃ 30 min后进行检测,相对标准偏差＜15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1 pg/μl。 结论  qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。     

Thyroid hormone receptor isoform selectivity of thyroid hormone disrupting compounds quantified with an in vitro reporter gene assay

Some compounds, including brominated diphenyl ethers (BDEs), can interfere with thyroid hormone (TH) receptor (TR)-mediated TH-signalling. In this study, the TR isoform selectivity of some TH disrupting compounds was investigated with TR/β specific reporter gene assays. For this purpose, the effects of compounds on 3,3′,5-triiodothyronine (T₃)-induced TR- or TRβ-activation were tested in green monkey kidney fibroblast (CV-1) cells transiently transfected with Xenopus TRs and a luciferase reporter gene. The T₃-like BDE-OH and diiodobiphenyl (DIB) increased T₃-induced TR-activation, but not T₃-induced TRβ-activation. BDE28 (100 nM) did not act via TR, but almost tripled T₃-induced TRβ-activation relative to T₃ at its EC₅₀. BDE206 (100 nM) was antagonistic on both TRs with a maximum repression −54% relative to T₃ at its EC₅₀. Contrary to previous results obtained with the T-screen, HBCD was inactive. The present study illustrates the importance of testing potential TH disrupting compounds in model systems that enable independent characterization of effects on both T₃-induced TRs.     

Novel glucagon receptor antagonists with improved selectivity over the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor

Optimization of a new series of small molecule human glucagon receptor (hGluR) antagonists is described. In the process of optimizing glucagon receptor antagonists, we counter-screened against the closely related human gastric inhibitory polypeptide receptor (hGIPR), and through structure activity analysis, we obtained compounds with low nanomolar affinities toward the hGluR, which were selective against the hGIPR and the human glucagon-like peptide-1 receptor (hGLP-1R). In the best cases, we obtained a >50 fold selectivity for the hGluR over the hGIPR and a >1000 fold selectivity over the hGLP-1R. A potent and selective glucagon receptor antagonist was demonstrated to inhibit glucagon-induced glycogenolysis in primary rat hepatocytes as well as to lower glucagon-induced hyperglycemia in Sprague-Dawley rats. Furthermore, the compound was shown to lower blood glucose in the ob/ob mouse after oral dosing.     

基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立

目的建立基于抗氧化反应元件(antioxident responseelement,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物。方法构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响。结果在加入25μmol.L-1H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100μmol.L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用最强,金雀异黄素诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25μmol.L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用最强,茨非醇诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.5倍。结论利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物。     

E0703对雌激素受体(ER)不同亚型的选择性激活作用

目的探讨E0703(雌二醇衍生物)对雌激素受体不同亚型(α和β)的选择性激活作用。方法将报告基因质粒pTAL-SEAP-ERE和校正质粒pSV-β-gal共转染已稳定转染了雌激素受体α/β的人胚肾细胞(HEK293),加入E0703进行报告基因的诱导表达。采用EMSA试验观察E0703对ERα与雌激素反应元件(ERE)的结合增强作用。结果E0703对ERα具有较强的激活作用(最低激活浓度为10-8mol·L-1),激活强度略低于E2;E0703在10-10、10-9、10-8、10-7mol·L-1浓度下对ERβ没有激活作用;EMSA试验证明,E0703能够增强ERα与雌激素反应元件的结合增强作用。结论E0703对雌激素受体α具有选择性激活作用。     

抗新型冠状病毒卵黄抗体对病毒及变异株的体外中和作用

目的 研究抗新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin，IgY）在体外对SARS-CoV-2及其变异株的中和抑制作用，探讨其作为鼻腔/口腔喷雾剂用于预防和阻断SARS-CoV-2感染的可能性。方法 采用间接ELISA检测抗SARS-CoV-2 IgY原液及成品对刺突（spike，S）蛋白的抗体效价；用微量细胞病变法检测其对SARS-CoV-2的中和活性；用萤光素酶发光法检测其对SARS-CoV-2假病毒的中和作用。结果 抗SARS-CoV-2 IgY原液的抗S抗原效价为1:32 000~1:64 000，成品的效价为1:16 000~1:32 000；两批原液对活病毒的中和效价分别为1:128和1:256，相应的抑制中浓度（median inhibitory concentration，IC₅₀）分别为36.22和36.50 μg/ml；成品对SARS-CoV-2假病毒的IC₅₀均值分别为4.571 μg/ml（WT）和6.07 μg/ml（D614G）；对变异株假病毒的IC₅₀分别为15.09~29.94 μg/ml（B.1.1.7）、41.71~55.56 μg/ml（B.1.351）和16.66~32.33 μg/ml（B.1.617.2）。结论 抗SARS-CoV-2 IgY与SARS-CoV-2重组S蛋白具有良好的结合活性，在体外能显著地中和SARS-CoV-2活病毒、假病毒及变异株假病毒，有望用于SARS-CoV-2感染的预防和阻断。     

5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺的建立与优化

目的 建立一种应用脱氧胆酸钠沉淀和离子交换色谱技术纯化5型肺炎球菌荚膜多糖的方法。方法  5型肺炎球菌发酵液经离心、超滤、脱氧胆酸钠沉淀处理后,再经过Capto Q离子交换层析,得到精制多糖原液。依据中国药典2020年版三部的相关制检规程对精制多糖原液进行检定分析。结果  发酵液中蛋白质和核酸杂质去除率分别达到97.0%和99.9%以上,糖醛酸含量不低于18.4%,氨基己糖含量不低于22.7%,各项指标均符合中国药典标准;且多糖收率达到60.0%以上。结论  建立的5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺可替代使用乙醇或苯酚的工艺,且操作步骤简便,具有很好的规模化应用前景。     

人胰高血糖素样肽-1类似物基因治疗对糖尿病大鼠机体代谢的影响

目的观察人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)类似物基因(2×Val2-hGLP-1)对糖尿病大鼠模型机体代谢的影响。方法建立糖尿病大鼠模型,尾静脉注射携带hGLP-1类似物基因的重组表达载体(pIRES2-EGFP/Val2-hGLP-1),观察30d,期间测定相关指标。结果治疗后糖尿病大鼠体重、进食及饮水量改善明显(P<0.01)。治疗15d后,血糖水平由(27.06±1.73)mmol/L降至(17.57±2.17)mmol/L(P<0.01),血清胰岛素水平由(5.53±0.79)mIU/L升高至(9.88±0.96)mIU/L(P<0.01)。总胆固醇水平降低(P<0.05或P<0.01)。hGLP-1蛋白在胰腺、肝、肾、肌肉组织中表达。结论 hGLP-1类似物基因可导入糖尿病大鼠体内并成功表达,基因治疗降低大鼠血糖,血脂水平,改善大鼠的机体代谢。     

兔抗肠道病毒71型血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响

目的 研究兔抗肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）血清制备中不同免疫剂量对抗体效价的影响。方法 将9只实验兔简单随机分为3组,每组3只。5、50和100 μg 3个剂量EV71灭活疫苗和弗氏佐剂均匀混合后,通过肌内注射途径分别免疫3组动物,于第0、7、14及28天各免疫1次,每7天采血,分离血清,检测抗EV71中和抗体效价。结果 100 μg剂量组兔血清抗体效价显著高于5和50 μg剂量组（第42天t值分别为–3.282和–2.486,P值均<0.05）。第42天时,兔血清抗体效价和免疫剂量（5~100 μg范围内）呈线性关系,回归方程y=478.229x–2 041.820。结论 在本实验选择的3个免疫剂量中,随着免疫剂量升高,产生的血清抗体效价也升高,且呈线性关系。