麦冬皂苷D通过上调CYP2J3/EET减轻H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤（英文）

目的探讨麦冬皂苷D(OP-D)对H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法通过H_2O_2诱导建立H9c2细胞氧化损伤模型,细胞分为正常对照组(予以无血清培养基培养28 h)、H_2O_2损伤模型组(H_2O_2400μmol·L~(-1)处理3 h)、OP-D 5,10和20μmol·L~(-1)预处理组(OP-D预处理24 h后+H_2O_2400μmol·L~(-1)处理3 h)、花生四烯酸CYP环氧酶活性抑制剂6-(2-炔丙基羟苯基)己酸(PPOH)干预组(OP-D20μmol·L~(-1)+PPOH 10μmol·L~(-1),PPOH于OP-D处理前1 h加入细胞)。MTT法测定细胞活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测环氧-二十碳-三烯酸(11,12-DHET和14,15-DHET)含量,ELISA法检测细胞内丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,流式细胞术(FCM)检测活性氧(ROS)水平及细胞凋亡水平、Western印迹法检测细胞色素P450 2J3(CYP2J3)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白和磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-e NOS)蛋白在细胞中的表达,利用PPOH进一步验证OP-D减轻细胞氧化应激的可能内在机制。结果 H_2O_2400μmol·L~(-1)明显抑制H9c2细胞存活率(P<0.01),OP-D可明显增加H_2O_2损伤后细胞存活率(P<0.01);不同浓度OP-D增加11,12-DHET和14,15-DHET含量(P<0.05,P<0.01);OP-D增加H_2O_2损伤后细胞NO含量(P<0.05,P<0.01)、增强SOD活性(P<0.05)及降低MDA、LDH含量(P<0.05,P<0.01);OP-D显著降低H_2O_2损伤后细胞氧化应激及凋亡水平(P<0.05,P<0.01);OP-D预处理上调H_2O_2损伤后细胞CYP2J3蛋白和m RNA表达(P<0.05,P<0.01)、激活PI3K/Akt-e NOS通路的磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);提前给予PPOH后,OP-D保护效应被抑制(P<0.05,P<0.01)。结论 OP-D能减轻H_2O_2所致的H9c2细胞损伤,可能是通过诱导CYP2J3表达及增加11,12-DHET和14,15-DHET含量,激活PI3K通路促进其下游因子Akt和e NOS磷酸化发挥作用。     

人诱导性多能干细胞源性小胶质细胞诱导方法的建立及其表型和功能的初步研究

目的建立人诱导性多能干细胞(hiPSC)诱导分化为小胶质细胞(hiMGL)的方法,研究hiMGL的表型及功能。方法按照本实验室前期建立的hiPSC向小胶质细胞诱导分化的方法,将健康老年人来源的外周血细胞重编程的hiPSC诱导分化为hiMGL。利用免疫荧光法检测小胶质细胞特异性表达蛋白TMEM119,Image Pro plus软件分析TMEM119阳性细胞率;分别采用LPS 0.5,1,2,4 mg·L~(-1)和H_2O_2 5,25,125,625μmol·L~(-1)刺激hiMGL 24 h后,应用CCK8法检测细胞活力;采用中性红检测细胞的吞噬功能。结果hiMGL表达小胶质细胞特异性表面标记物TMEM119,hi MGLs TMEM119阳性率为78%。在LPS 0.5～4 mg·L~(-1)刺激下,hiMGL细胞活力和吞噬能力与Control组相比均有升高,在LPS 2 mg·L~(-1)刺激下活力上升最为明显(P<0.05);在LPS 1,2 mg·L~(-1)刺激下吞噬功能增强最为明显(P<0.05)。在H_2O_2 5-125μmol·L~(-1)刺激下,hi MGL细胞活力无明显改变,吞噬功能增强;在H_2O_2 25μmol·L~(-1)的刺激下其吞噬功能与Control组相比增强最为明显(P<0.01);H_2O_2 625 mol·L~(-1)刺激下hiMGL活力和吞噬能力都明显下降(P<0.01)。结论本实验室诱导分化的hiMGL能够表达小胶质细胞特异性标记蛋白TMEM119,面对炎性刺激和氧化应激刺激其活力及吞噬功能均可受到影响。该结果提示,hiMGL在一定程度上具备小胶质细胞的表型及功能,为后续应用hiMGL研究神经退行性疾病奠定研究基础。     

九龙藤黄酮对H_2O_2诱导乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用

目的研究九龙藤黄酮(BCF)对H_2O_2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用及机制。方法原代培养乳鼠心肌细胞,采用100 p,mol-L^(-1)H_2O_2孵育16 h建立心肌细胞凋亡模型,随机建立正常组、模型组、维生素C(终浓度100 mg·L(-1)H_2O_2孵育16 h建立心肌细胞凋亡模型,随机建立正常组、模型组、维生素C(终浓度100 mg·L^(-1))预处理组及不同浓度BCF(终浓度分别50、100、200 mg·L(-1))预处理组及不同浓度BCF(终浓度分别50、100、200 mg·L^(-1))预处理组。各给药组均于造模前给药孵育2h。MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法测定心肌细胞凋亡率。ELISA法测定细胞培养上清液肿瘤坏死因子(TNF)-α,分光光度法测定总抗氧化活力(T-AOC),免疫组化方法观察Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与模型组相比,不同浓度BCF预处理组的心肌细胞存活率、T-AOC和Bcl-2蛋白表达均显著增高(P<0.01或P<0.05);而INF-α、Bax蛋白表达、心肌细胞凋亡率均显著下降(P<0.01或P<0.05)。与维生素C组相比,BCF各浓度组无显著差异(P>0.05)。结论 BCF可抑制H_2O_2引起的乳鼠心肌细胞凋亡,其作用机制可能与抗脂质过氧化、降低TNF-α、上调Bcl-2及下调Bax蛋白表达有关。     

根皮苷对过氧化氢诱导损伤PC12细胞的保护作用

目的探讨根皮苷对过氧化氢(H2O2)诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法以H_2O_2损伤PC12细胞建立氧化损伤模型,随机分为空白对照组、模型组(400μmol·L~(-1) H_2O_2)、阳性对照(20μmol·L~(-1)N-乙酰半胱氨酸)组和不同浓度根皮苷(16、32、64μmol·L~(-1))预处理组。采用MTT法检测细胞活力,显微镜观察细胞形态,ELISA检测细胞活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot检测NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达。结果模型组细胞活力较空白对照组显著降低,ROS和MDA含量增加,SOD活力下降,Nrf2和HO-1蛋白表达下降(均P<0.05)。根皮苷低、中、高浓度(16、32、64μmol·L~(-1))组较模型组细胞存活率均显著提高,ROS和MDA含量降低,SOD活力升高,Nrf2和HO-1蛋白表达上调(均P<0.05)。结论根皮苷能够抑制H_2O_2对PC12细胞的氧化损伤,其保护作用可能与抑制氧化应激引起的细胞死亡并调控Nrf2信号通路有关。     

氯丙烯对大鼠血清中氧化-抗氧化功能的影响

目的探讨氯丙烯亚慢性染毒对大鼠血清中氧化-抗氧化功能的影响。方法选用雄性Wistar大鼠分别以100或200 mg/kg剂量灌胃3个月,测定大鼠血清中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽还原酶(GR)活力的变化。结果与对照组相比,大鼠血清中GSH含量及T-SOD、T-AOC、GR活性显著降低,其中低剂量组分别降低13.4%、11.1%、22.4%和16.6%(P<0.01),高剂量组分别降低17.5%、24.6%、34.8%和28.1%(P<0.01);MDA含量及GSH-Px活力有增加趋势(P>0.05);ROS含量低剂量组增加12%(P<0.01),高剂量组增加20%(P<0.01)。结论氯丙烯亚慢性染毒可导致大鼠血清中活性氧成分明显增加,抗氧化能力明显减弱,T-AOC及GR活力变化幅度最大。     

过氧化氢诱导血管平滑肌细胞内质网应激及其自噬作用

目的观察过氧化氢(H_2O_2)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)内质网应激及其自噬的作用机制。方法体外培养VSMC细胞,加入H_2O_250,100,200,400,600,800,1200和1600μmol·L~(-1)分别作用12和24 h后,MTT法检测H_2O_2对VSMC的抑制率;倒置相差显微镜观察H_2O_2对VSMC细胞形态的影响;采用间接免疫荧光法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)和泛素结合蛋白p62的表达,采用Western蛋白印迹法检测自噬相关蛋白人卷曲螺旋肌球蛋白样BCL2相互作用蛋白/自噬基因(Beclin-1)和LC3、内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及自噬上游信号通路哺乳动物西罗莫司(雷帕霉素)靶蛋白(m TOR)的表达。结果 MTT结果显示,H_2O_250~1600μmol·L~(-1)作用VSMC细胞12和24 h,VSMC细胞存活率明显降低,12和24 h的IC50分别为(597.2±2.3)和(447.4±1.7)μmol·L~(-1)。倒置相差显微镜观察可见H_2O_2400μmol·L~(-1)组VSMC收缩变圆。H_2O_2400μmol·L~(-1)作用VSMC 12 h时,细胞存活率由(97.5±0.1)%下降至(74.4±1.0)%;作用VSMC 24 h,下降至(56.8±0.9)%(P<0.01)。激光共聚焦显微镜检测发现,H_2O_2400μmol·L~(-1)作用VSMC 8 h,细胞浆中LC3和p62蛋白随H_2O_2作用时间的延长表达增加。LC3与p62的共定位显示,H_2O_2400μmol·L~(-1)作用8 h最明显。Western蛋白印迹结果表明,H_2O_2诱导内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP和自噬相关蛋白Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著增加(P<0.01),m TOR的表达显著降低(P<0.01)。结论 H_2O_2可能通过诱导VSMC内质网应激激活自噬。     

淫羊藿苷对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制

目的研究淫羊藿苷(Ica)对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤的保护作用及其机制。方法 H_2O_2诱导氧化损伤模型。药效学研究分为六组:空白组,模型组(750μmol·L-1 H2O2),Ica-L、M、H组(750μmol·L~(-1) H_2O_2+1×10-8、1×10-7、1×10-6mol·L~(-1)Ica)和溶媒组(0.1%DMSO)。Ica给药12 h后加入H_2O_2,Ica作用时间为24、36和48 h。Ica作用机制研究分为五组:空白组、模型组、Ica-H组、LY组(750μmol·L~(-1) H_2O_2+25μmol·L~(-1)LY294002)、Ica-H+LY组。LY294002为PI3K抑制剂,给予LY294002后2 h加入Ica,12 h后加入H_2O_2,Ica作用时间为48 h。MTT法检测细胞活力,ELISA检测细胞培养液中活性氧(ROS)的含量,显微镜观察细胞形态及存活细胞密度,Annexin V-FITC/PI染色荧光显微镜观察细胞凋亡率,Real time RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA的表达,Western Blot检测p-Akt和Akt蛋白的表达。结果与空白组相比,模型组细胞活力降低(P<0.01),ROS分泌量和凋亡细胞增加(P<0.01);与模型组相比,Ica-L、M、H组均能提高细胞活力(P<0.01),降低细胞培养液中ROS的含量(P<0.05),其抑制率呈现时间和剂量依赖性。同时,Ica能明显降低细胞凋亡率(P<0.01),上调p-Akt蛋白和Bcl-2 m RNA的表达(P<0.05),下调Bax mRNA的表达(P<0.05);Ica的以上作用被LY294002拮抗。结论 Ica(1×10~(-8)-1×10-6 mol·L~(-1))对H_2O_2诱导的HUVEC氧化损伤有保护作用,能缓解氧化应激诱导的HUVEC凋亡,其机制与PI3K/Akt信号通路有关。     

银杏二萜内酯葡胺注射液通过激活Akt/Nrf2通路抑制缺糖缺氧诱导的SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤

目的探讨银杏二萜内酯葡胺注射液(DGMI)抑制缺糖缺氧(OGD)诱导人源性神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的氧化应激损伤及其机制。方法 SH-SY5Y细胞随机分为正常细胞对照组,OGD模型组,OGD 4 h+DGMI 25 mg·L~(-1)组,OGD 4 h+银杏叶提取物注射液(EGBLI)25 mg·L~(-1)组,OGD 4 h+银杏内酯注射液(LGBI)25 mg·L~(-1)组。药物作用6 h后,CCK-8法检测细胞存活,水溶性四唑盐1(WST-1)显色法法检测SOD活性,荧光探针法(DCFH-DA)检测ROS生成,Western蛋白印迹法检测细胞内血红素加氧酶(HO-1)、醌氧化还原酶(Nqo1)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、细胞内核因子E2相关因子2(Nrf2)、磷酸化Nrf2(p-Nrf2)的表达;OGD 4 h+DGMI 25 mg·L~(-1)组加入PI3K抑制剂LY294002(终浓度为0,12.5,25和50μmol·L~(-1)),检测1 h后Akt,p-Akt,Nrf2和p-Nrf2的蛋白表达。结果与正常细胞对照组相比,OGD模型组SH-SY5Y细胞存活和SOD活性降低(P<0.01),ROS含量升高(P<0.01),降低p-Akt,Nrf2,p-Nrf2,HO-1和Nqo1的表达(P<0.01);与OGD模型组相比,OGD 4 h+药物组作用6 h,细胞存活率和SOD活性显著提高(P<0.01),ROS含量降低(P<0.05,P<0.01),p-Akt,Nrf2,p-Nrf2,HO-1和Nqo1蛋白表达水平提高(P<0.01),且DGMI 25 mg·L~(-1)效果优于EGBLI 25 mg·L~(-1)和LGBI 25 mg·L~(-1)(P<0.05,P<0.01);相较DGMI组,DGMI和LY294002作用1 h后p-Akt和p-Nrf2的表达被显著抑制(P<0.01),抑制效果呈浓度依赖性。结论 DGMI 25 mg·L~(-1)对OGD诱导的SH-SY5Y细胞具有抗氧化保护作用,其机制可能与激活Akt/Nrf2通路有关。     

槲皮素通过调控PI3K/Akt信号通路对血管内皮祖细胞发挥保护作用

目的探讨槲皮素(quercetin,Que)对氧化应激情况下血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的保护作用及其作用机制。方法分离并诱导分化人脐血EPCs,随机分为对照组;过氧化氢(H_2O_2)组:加入500μmol·L~(-1)的H_2O_2,建立氧化应激损伤EPCs模型;Que干预组:先分别加入浓度为60、90μmol·L~(-1)的Que预处理30 min后,再加500μmol·L~(-1) H_2O_2共同培养,培养12、24、48 h后,WST-1法观察EPCs增殖情况;Western blot检测Akt、磷酸化Akt的表达水平;实时荧光RT-PCR法检测PI3K、Akt3 mRNA的表达水平。结果与空白对照组对比,经过H_2O_2处理的EPCs增殖能力明显降低,且EPCs的Akt蛋白表达明显下降,PI3K、AKT3 mRNA明显下降(P<0.01,P<0.05)。加入60、90μmol·L~(-1) Que处理12、24、48 h后,损伤的EPCs细胞增殖能力明显增加,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。同时明显升高EPCs磷酸化Akt的蛋白表达(P<0.05),以及PI3K、AKT3 mRNA表达(P<0.01)。结论槲皮素对H_2O_2诱导血管EPCs氧化应激损伤起到修复作用,其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路,减少氧化应激对脑血管病灶的影响,促进脑血管EPCs增殖和分化。     

卡维地洛与氢氯噻嗪对原发性高血压患者血管活性物质的影响

目的探讨氢氯噻嗪、卡维地洛单用或联用对轻中度原发性高血压患者血压和血浆肾上腺髓质素(AM)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及丙二醛(MDA)水平的影响。方法107例新发现的或不规则服降压药但已停药2 wk以上的轻中度原发性高血压患者随机分为3组,分别服用氢氯噻嗪(12.5～25 mg·d~(-1))、卡维地洛(25～50 mg·d~(-1))、卡维地洛和氢氯噻嗪(分别为12.5 mg·d~(-1)和12.5～25 mg·d~(-1),分别测量治疗前和治疗8 wk后血压和AM、AngⅡ及MDA浓度。结果氢氯噻嗪组、卡维地洛组和卡维地洛/氢氯噻嗪组血浆AM浓度治疗前后分别为(60.41±17.13)ng·L~(-1)vs(51.70±20.35)ng·L~(-1)(P<0.05);(65.41±18.62)ng·L~(-1)vs(49.39±18.55)ng·L~(-1)(P<0.01);(62.08±21.50)ng·L~(-1)vs(47.97±18.71)ng·L~(-1)(P<0.01)。卡维地洛组和卡维地洛/氢氯噻嗪组治疗后较治疗前血浆AngⅡ水平下降(35.51±32.31)ng·L~(-1)vs(18.21±14.61)mg·L~(-1)(P<0.01);(30.81±31.02)ng·L~(-1)vs(17.71±12.85)ng·L~(-1)(P<0.05);同时血浆MDA水平也下降分别为(10.19±3.23)mmol·L~(-1) vs(6.98±2.88)mmol·L~(-1)(P<0.01);(9.79±2.71)mmol·L~(-1)vs(6.61±2.74)mmol·L~(-1)(P<0.01);而氢氯噻嗪组治疗前后血浆AngⅡ、MDA浓度变化差异无统计学意义。结论低剂量氢氯噻嗪和卡维地洛联合应用安全性好,降压效果明确,具有降低血浆AM浓度的作用,起到了协同降压的作用。