提高BrdU标记成年大鼠在体脑神经干细胞增殖和分化效率的研究

目的探讨合理利用BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）单标成年在体脑神经干细胞增殖以及双标成年在体脑神经干细胞分化的策略。方法在BrdU通过腹腔注射6h后或在BrdU腹腔注射后14～21d将大鼠灌注固定,继之用邻片进行H—E染色以作定位,分别对脑组织切片进行BrdU单标或BrdU＋NT（神经丝,成熟神经元的标志物）、BrdU＋GFAP（胶质原纤维酸性蛋白,成熟星形胶质细胞的标记物）以及BrdU＋GC（半乳糖脑苷脂,成熟少突胶质细胞的标记物）的双标免疫组织化学反应,光镜下观察和计数单标或双标的阳性细胞。结果BrdU单标阳性细胞多见于侧脑室的SVZ（室管膜下区）和SGZ（齿状回颗粒下区）,而BrdU＋NT阳性细胞多位于嗅球和齿状回的颗粒细胞层,BrdU＋GFAP阳性细胞多见于SVZ或SGZ;BrdU＋GC阳性细胞数最少,散在分布于以上四个部位内。结论在进行BrdU标记脑神经干细胞前应该制定优化组合方案,以获得最佳的单标和双标的识别效果。     

成年大鼠脑神经干细胞表达PCNA和Ki-67抗原的比较研究

目的比较成年大鼠侧脑室管膜下区（SVZ）和齿状回颗粒下区（SGZ）神经干细胞表达增殖细胞核抗原（PCNA）和Ki-67抗原的动态变化。方法采用免疫组织化学方法,分别对成年雄性SD大鼠SVZ和SGZ的PCNA阳性细胞及Ki-67阳性细胞进行定性和定量研究。结果PCNA或Ki-67免疫反应产物均位于细胞核,两种细胞的形态及分布也相似,但在SGZ或SVZ内的PCNA阳性细胞数均明显低于Ki-67阳性细胞数（P〈0.05）。结论PCNA和K-67联合应用可以更全面和准确地评估成年在体神经干细胞的增殖状态。     

脑梗死大鼠原位神经干细胞的增殖和分化

目的研究成年大鼠脑梗死后原位神经干细胞的增殖和分化。方法运用BrdU标记法检测脑局灶梗死大鼠侧脑室下区(SVZ)与海马齿状回颗粒细胞层下区(SGZ)原位神经干细胞的增殖情况,运用荧光双标法检测其分化的细胞表型。结果SVZ BrdU 细胞数量于脑梗死后1 d开始升高(P<0.01),而SGZ BrdU 细胞则于梗死后4 d开始升高。SVZ与SGZ BrdU 细胞均于7 d达到高峰(P<0.01),14 d开始下降(P<0.01),至28 d后与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。半定量显示脑梗死7 d后,SVZ与SGZ BrdU 细胞数分别较假手术组升高5倍和8倍。对原位神经干细胞分化的研究发现,脑梗死后35 d在梗死侧大脑半球,BrdU 细胞总数中约(73.5±15.7)%表达神经元细胞表型NeuN,(37.6±9.9)%表达胶质细胞表型GFAP。结论大鼠脑梗死能刺激原位神经干细胞的增殖并促进了神经再生。     

caspase-3在海马损伤后齿状回神经发生调控中的作用

目的探讨成年大鼠海马CA1区损毁后,齿状回（DG）细胞先增殖后减少的原因。方法用海人酸（KA）建立单侧海马损毁模型;用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记海马DG区增殖的细胞,用免疫组织化学方法检测标记后不同时间点DG区BrdU阳性细胞,并用无偏差体视学方法定量分析;激光共聚焦显微镜检测BrdU与裂解的caspase-3的共表达。结果实验组动物在损毁海马后各时间点DG区BrdU阳性细胞总数均比对照组明显增多,差异有统计学意义（P〈0.05）;各组动物BrdU阳性细胞总数在标记后第1天最多,随着时间的延长逐渐减少;在颗粒细胞层和门区均有少量BrdU/cleaved caspase-3共表达的阳性细胞。结论损毁成年大鼠海马CA1区后,增殖的细胞总数随着时间的延长逐渐减少,其机制可能与caspase-3相关的细胞死亡及异位迁移有关。     

大鼠短暂性局灶性脑缺血后神经发生、碱性成纤维细胞生长因子表达及其相互关系的研究

目的：观察大鼠短暂性局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下层和齿状回颗粒下层神经发生及相关区域碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达。方法：通过大脑中动脉阻断法(MCAC))建立短暂性局灶性脑缺血模型；用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA合成期(S期)细胞；用HE染色观察缺血后神经元坏死情况，免疫组化观察大鼠局灶性脑缺血60min后不同时间侧脑室室管膜下层、齿状回颗粒下层BrdU标记的阳性细胞、脑缺血后不同时间在有神经发生区域的bFGF表达情况。结果：①在缺血侧，缺血后4d，SVZ的BrdU标记的阳性细胞明显增加，7d时达到峰值，缺血对侧SVZ也有增加，但增加幅度稍小，10d时达到峰值，峰值过后，两侧的阳性细胞量均有下降；②缺血后bFGF在各脑区均有增加表达。在SVZ，缺血侧在缺血后12h即开始增加表达，24h达到峰值，随后下降。在海马CA2区，缺血侧缺血后5d有表达显著增加，8d时达到峰值，随后下降。结论：大鼠短暂性局灶性脑缺血促进了SVZ的神经发生。这种反应与bFGF等生长因子的表达增加导致内环境的变化有关。     

全脑照射对小鼠室管膜下区GFAP表达及细胞增殖的影响

目的：探讨60Co-γ射线全脑照射对小鼠室管膜下区星形胶质细胞GFAP表达及细胞增殖的影响。方法：将56只昆明小鼠随机分成4组,每组14只,分别以0,5,15 Gy和30 Gy剂量进行照射,分别观察照射后1周和4周室管膜下区的GFAP和BrdU阳性细胞形态和数目。结果：①照射后1周,15 Gy组和30 Gy组室管膜下区GFAP阳性细胞数明显增多（P〈0.01）,BrdU阳性细胞数明显减少（P〈0.01）;②照射后4周,15 Gy组室管膜下区GFAP阳性细胞数仍明显增多（P〈0.01）,但其BrdU阳性细胞数恢复到对照组水平;30 Gy组室管膜下区GFAP阳性细胞数恢复到对照组水平,但BrdU阳性细胞数仍明显减少（P〈0.01）。结论：放射后室管膜下区GFAP表达可能与神经干细胞的增殖有关。     

川芎嗪对成年大鼠脑缺血再灌注损伤后nNOS的表达和神经的影响

目的 探讨川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织内神经元型一氧化氮合酶免疫阳性细胞表达变化,及其对海马齿状回、侧脑室室下区神经细胞增殖的影响.方法 动物分为正常组、假手术组、对照组、川芎嗪处理组.脑缺血再灌注损伤模型由线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MACO)制成.BrdU标记增殖细胞.免疫组化SABC法测定大鼠脑缺血再灌注损伤后,不同脑区在不同时间段的nNOS、BrdU免疫阳性细胞表达,Western blotting测定大鼠脑缺血再灌注损伤后,不同脑区在不同时间段的nNOS的表达.结果 免疫组化结果显示在大脑皮层、纹状体与尾壳核和海马均有nNOS的表达,Western blotting结果显示,对照组缺血侧各脑区内,nNOS表达较假手术组升高(P＜0.05),并随时间延长而递增.川芎嗪处理组大脑皮层、纹状区与尾壳核nNOS表达1、3 d组比对照组同时段表达降低(P＜0.05).川芎嗪处理组BrdU阳性细胞在侧脑室室下区(SVZ)缺血再灌注1、3 d组明显高于对照组(P＜0.05),川芎嗪处理组BrdU阳性细胞在海马齿状回(DG)缺血再灌注3 d、7 d组高于对照组(P＜0.05).结论 川芎嗪能抑制缺血后脑组织内早期nNOS的表达,对缺血后脑组织具有早期保护作用,并能促进SVZ和DG神经细胞增殖.     

成年和老年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区细胞增殖的比较研究

目的：比较老年和成年大鼠局灶性脑缺血后室管膜下区(the subventricular zone，SVZ)神经干细胞的增殖情况。方法：制作大脑中动脉梗塞模型，用免疫组织化学方法动态检测室管膜下区5-溴脱氧尿嘧啶(bromndeoxyuridine，BrdU)标记的阳性细胞数的变化：结果：正常组和假手术组成年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞明显多于老年大鼠。实验组成年和老年大鼠SVZ的BrdU阳性细胞均在缺血后3d开始增加，7d时达到高峰，28d时仍高于正常水平，且成年大鼠各时间点SVZ的BrdU阳性细胞均明显高于老年大鼠。结论：大鼠脑缺血激活SVZ神经干细胞增殖，成年大鼠干细胞增殖能力强于老年大鼠。     

川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤脑室下区细胞增殖的影响

目的:观察川芎嗪(ligustrazine)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤侧脑室室下区(subventricular zone,SVZ)细胞增殖的影响.方法:将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常组、假手术组、川芎嗪治疗组和对照组.采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记增殖细胞并用免疫组织化学方法检测BrdU阳性细胞并对SVZ区BrdU阳性细胞计数.采用Western blot检测神经元型一氧化氮合酶(neuro nitric oxide synthase,nNOS)的表达,并测定吸光度值.结果:正常组、假手术组SVZ有少量BrdU阳性细胞,川芎嗪治疗组、对照组SVZ区BrdU阳性细胞再灌注后1 d开始出现,逐渐增加,7 d达到峰值,持续至14 d,在21 d时下降.川芎嗪治疗1 d和3 d组BrdU阳性细胞明显多于对照组(P＜0.01).在缺血对侧SVZ也有细胞增殖,川芎嗪治疗组、对照组在各时间点的变化与缺血侧相似.川芎嗪治疗1 d,3 d组nNOS表达量明显低于对照组(P＜0.05),川芎嗪治疗7 d组与3 d组相比nNOS表达量增加,但与缺血对照组相比无统计学差异.结论:川芎嗪促进局灶性脑缺血再灌注损伤后SVZ区的细胞增殖,其机制可能与nNOS的表达下降有关.     

葛根素对去卵巢雌性大鼠脑内BDNF表达和神经干细胞增殖的影响

目的:观察葛根素对去卵巢雌性大鼠脑内脑源性神经营养因子(BDNF)表达和神经干细胞增殖的影响。方法:将60只去卵巢雌性大鼠随机分为三组:空白对照组(腹腔注射生理盐水)、阳性对照组(腹腔注射17β雌二醇)、药物干预组(腹腔注射葛根素注射液)。4周后处死大鼠,比较各组大鼠脑内双侧脑室管膜下区(SVZ)BDNF免疫组化阳性细胞数、BrdU阳性细胞数的差别。结果:雌激素组和葛根素组SVZ区BDNF免疫组化阳性细胞数、BrdU阳性细胞数较生理盐水组明显增多。结论:葛根素能增加去卵巢大鼠(SVZ)区神经干细胞的增值,机制可能是依靠其雌激素样作用促进脑源性神经营养因子达到。     

CXCR4在大鼠海马齿状回发育过程中的表达变化

目的 探讨趋化因子受体CXCR4在不同发育阶段大鼠海马齿状回（DG）区发育过程中的表达变化规律.方法 运用免疫印迹、免疫组织化学染色方法分析不同发育时期大鼠海马DG区CXCR4的表达情况.结果 免疫印迹结果显示,海马DG区CXCR4于出生后1周达最高水平（P〈0.05）,随后呈下降趋势,4周后渐降至成年水平.免疫组化结果显示,CXCR4阳性细胞的胞质呈棕黄色着色,并主要表达于齿状回颗粒细胞下层.结论 研究结果提示CXCR4在生后大鼠海马DG区的表达具有时空差异性,这种差异可能与生后海马DG区细胞结构和功能的发育密切相关.     

自噬在海马损伤后齿状回神经发生调控中的作用

目的探讨成年大鼠单侧海马CA1区毁损后,海马齿状回（DG）神经发生新生细胞存活与自噬的关系。方法建立海人酸（KA）损毁单侧海马的模型,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）于毁损后3d标记增殖的细胞,免疫组织化学检测BrdU阳性细胞,采用体视学的计数方法计算DG的BrdU阳性细胞总数。用自噬特异性抗原微管相关蛋白轻链3（LC-3）与BrdU双标的方法检测这些新生细胞的减少是否有自噬的参与。结果假毁损组DG区可见少量的BrdU阳性细胞;与假毁损组比较,实验组在海马毁损后DG区BrdU阳性细胞明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）,在BrdU给药后第1天最多,随着时间的推移逐渐减少,各组之间差异有统计学意义（P〈0.05）;各时间点均未见BrdU和LC-3双标细胞。结论成年大鼠海马毁损可增强DG的神经发生,新生细胞随着时间的推移逐渐减少,而自噬性程序性细胞死亡在新生细胞减少的调控中可能不占主导作用。     

创伤性脑损伤对大鼠齿状回神经细胞新生的影响

目的：观察成年大鼠创伤性脑损伤后齿状回神经细胞新生的变化。方技：将雄性Wistar大鼠分为假手术组和液压打击脑创伤组,使用5-溴脱氧尿核苷（BrdU）标记新生细胞,免疫组织化学方法观察脑损伤后大鼠齿状回神经细胞新生水平的变化和规律。结果：成年大鼠创伤性脑损伤后,在第3、7、14天,创伤组齿状回BrdU免疫阳性细胞数较假手术组明显增加（P〈0．05）,以受伤侧齿状回变化最显著。结论：创伤性脑损伤可促进齿状回神经细胞新生。     

通心络对脑缺血再灌注损伤后大鼠内源性神经巢蛋白和碱性成纤维生长因子表达的影响

目的探讨通心络对脑缺血再灌注损伤后大鼠内源性神经巢蛋白(Nestin)和碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的影响。方法改良线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,分为模型组、通心络大剂量组(1.0 g·kg~(-1)·d~(-1))、通心络小剂量组(0.5 g·kg~(-1)·d~(-1))和假手术组。免疫荧光法检测各组大鼠缺血再灌注损伤后第3、5、7、14、21、30天病灶侧侧脑室下区(SVZ)、海马齿状回(DG)区5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和Nestin的变化,逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)方法检测相应时间点病灶侧碱性成纤维生长因子信使核糖核酸(bFGF mRNA)的表达。结果假手术组几乎检测不到BrdU+Nestin和bFGF mRNA的表达。通心络大剂量和小剂量组第5、7、14、21、30天病灶侧SVZ、DG区BrdU+Nestin荧光强度值与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。第5、7、14、21、30天通心络大剂量组与通心络小剂量组BrdU+Nestin荧光强度值比较有统计学意义(P<0.05)。通心络大剂量和小剂量组第5天BrdU+Nestin阳性荧光强度值增加,第14天达最高(P<0.05),并持续到缺血再灌注后第30天。缺血再灌注后各时间点通心络大剂量和小剂量组分别与模型组bFGF mRNA表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。通心络大剂量和小剂量组bFGF mRNA表达在缺血再灌注后第3天开始增高,第7天表达值最高(P<0.05),并持续到第30天仍然有较高水平,而模型组第30天已恢复到基线水平。模型组、通心络大剂量组和通心络小剂量组组内不同时间BrdU+Nestin荧光强度值和bFGFmRNA表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠脑缺血再灌注损伤可引起病灶侧SVZ、DG区神经干细胞反应和增殖;通心络可显著增加大脑中动脉缺血及再灌注模型大鼠神经干细胞的增殖分化能力。通心络促使病灶侧bFGFmRNA表达上调可能为促进神经干细胞增殖分化的机制之一。     

胰岛素逆转1型糖尿病脑病模型大鼠海马齿状回神经发生障碍与空间学习记忆异常的研究

目的揭示海马齿状回神经发生与1型糖尿病脑病发病的相互关系以及用胰岛素干预后所发生的变化。方法分别用链脲佐菌素和胰岛素建立1型糖尿病脑病大鼠模型和胰岛素治疗大鼠模型,采用Morris水迷宫以及5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU,一种神经干细胞DNA合成的标记物）单标、BrdU＋NF（神经丝,成熟神经元的标志物）双标、BrdU＋GFAP（胶质原纤维酸性蛋白,成熟星形胶质细胞的标志物）双标的免疫组织化学方法,测试大鼠的空间学习记忆能力,并在光镜下观察处于海马齿状回神经发生过程中的细胞存活、迁移和分化的程度。结果1型糖尿病脑病模型大鼠的空间学习能力,海马齿状回BrdU单标、BrdU＋NF双标和BrdU＋GFAP双标的阳性细胞数均明显下降（P〈0.01）;用胰岛素治疗后可提升以上各项指标几乎接近正常水平（P〈0.01）,但各种阳性细胞形态以及细胞迁移的方向、路径和终点均不受到明显的影响。结论个体内长期缺乏胰岛素,导致海马齿状回神经干细胞生存率和分化率下降,可能是诱发1型糖尿病脑病的一个因素;尽早用胰岛素进行干预可逆转神经发生障碍和学习记忆异常,这将有利于防治该脑病的发生。     

三碘甲状腺原氨酸促进2VO大鼠侧脑室下区的神经再生

目的：探讨三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine,T3）对双侧颈总动脉结扎（2-vessel occlusion,2VO）大鼠侧脑室下区（subventri（sular zone．svz）神经再生的影响。方法：雄性SD大鼠完全随机分为假手术组,2VO组和缺血后T3干预组,每组8只,采用双侧颈总动脉永久性结扎术制备慢性脑缺血模型,术后各组大鼠连续7d腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine,BrdU）标记增殖细胞。各组5只分别于第7、14天灌注取脑组织,采用BrdU与Doublecortin（DCX）免疫荧光双染法标记新生神经元;各组3只取新鲜脑组织分离SVZ,采用免疫印迹法检测DCX蛋白的表达水平。结果：T3作用7d后,T3干预组BrdU阳性细胞较假手术组显著增多（P=0．002）,与2VO组差异无统计学意义（P=0．084）;且BrdU／DCX阳性细胞较2VO组和假手术组均显著增多（均P〈0．05）。T3作用14d后,T3干预组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞均显著多于2VO组和假手术组（P〈0．01）。与2VO7d组相比,2VO14d组BrdU阳性细胞和BrdU／DCX阳性细胞显著减少（P〈0．05）。免疫印迹法也显示T3组DCX蛋白的表达水平较多、结论：T3可促进慢性脑缺血大鼠侧脑室下区新生神经元的增殖,提高存活率,促进神经再生。