用Nested聚合酶链反应检测嗜肺军团菌的实验研究

用Nested聚合酶链反应(Nested PCR)法检测嗜肺军团菌种。Nested PCR法所用的两对寡核苷酸引物按编码24kDa嗜肺军团菌表面抗原的基团片段序列设计的。用此两对引物对实验的军团菌种和非军团菌种细菌DNA进行扩增，只有嗜肺军团菌种DNA披扩增，而其他军团菌种和非军团菌属细菌没有被扩增。第1步和第2步PCR分别检测到最小量为10pg和10fg的靶DNA。对不同量的嗜肺军团菌配制成的痰标本进行检测，能检测到0．1cfu／ml的嗜肺军团菌，只需12h。这些结果显示Nested PCR法检测嗜肺军团菌特异性强，敏感性高。此方法为从临床标本和环境材料中早期、快速检测到嗜肺军团菌提供了有救的工具。     

反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌

目的　探讨早期、快速检测嗜肺军团菌的方法。方法　根据嗜肺军团菌特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成一段特异的 2 6 0bp长链DNA探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细菌DNA ,并应用于痰标本的检测。结果　所合成的 2 6 0bpDNA探针具有高度特异性 ,只和嗜肺军团菌杂交 ,与其他细菌、真菌、病毒无交叉反应 ,该探针最低可检测出 1ng的细菌DNA。杂交法和培养法分别检测 10 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 8%和 2 %。结论　该方法快速、特异 ,对嗜肺军团菌的早期诊断具有较高的应用价值。     

基因扩增法检测军团杆菌DNA的研究

采用聚合酶链式反应建立检测军团菌 DNA 的实验诊断方法。结果显示,采用军团菌属5 SrRNA 编码区特异性引物进行扩增,11种军团菌(包括八种嗜肺军团菌)均可见104bp 的阳性扩增带;采用嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(mip)基因编码区特异性引物扩增,所有八种嗜肺军团菌均可见650 bp 的特异性扩增带,所有三种非嗜肺军团菌扩增结果为阴性。检测敏感性为60 fg 左右。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增检测法的建立

目的:建立一种快速简便的嗜肺军团菌分子检测方法.方法:运用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),设计一套引物特异性识别嗜肺军团菌毒力基因--mip基因的6个特殊区域,在恒温条件下,对8株嗜肺军团菌和5株其它细菌进行检测,并与普通PCR方法进行比对,验证该方法的特异性和灵敏度.结果:所有嗜肺军团菌扩增产物均产生肉眼可见的白色沉淀,而其它不同菌株均不产生沉淀;加入荧光染料smart green后,嗜肺军团菌扩增产物均产生强绿色荧光,其它菌株呈弱荧光.与普通PCR(检出限约为57.6 pg,)比,LAMP扩增反应的灵敏度大100倍左右,基因组DNA检出限为576 fg,阳性水样检出限为8 cfu/ml.结论:LAMP技术可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏地检测嗜肺军团菌.     

聚合酶链法检测环境水体中嗜肺军团菌

目的建立检测环境水体中嗜肺军团菌聚合酶链(PCR)法。方法以嗜肺军团菌特异性保守基因Mip为靶基因,采用Godkex软件设计引物,聚合酶链反应测定。结果该方法检测军团菌的灵敏度为5.8×102cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出996 bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0%。结论该方法快速、灵敏、特异,是检测水体中嗜肺军团菌的有效方法。     

以dotA基因为靶标的LAMP法快速检测嗜肺军团菌

目的建立一种简便、高效、特异、灵敏的快速检测军团菌肺炎致病原-嗜肺军团菌的方法。方法本研究分析了NCBI数据库中嗜肺军团菌IVB型分泌系统的序列,经过筛选建立了以dotA基因为靶标的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测法。为了验证该法的特异性,提取了约旦军团菌、马氏军团菌、沙门菌、不同血清型的嗜肺军团菌基因组DNA进行检测;为了验证该法的灵敏度,对梯度浓度的阳性模板进行了检测,并与普通PCR对比;最后还将该法实际应用于环境水样的检测。结果本法可于30 min内完成扩增;扩增产物电泳呈现LAMP特有的梯形条带,酶切产物的片段大小符合理论值;阳性产物中可见白色沉淀,加入溴乙锭后在紫外光下可见明亮的荧光,阴性产物无此现象。结论该dotA-LAMP嗜肺军团菌检测法的特异性好,灵敏度高于普通PCR,可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏、直观地检测出嗜肺军团菌,具备现场检测及基层推广的应用潜力。     

深圳市公共场所冷却塔水中嗜肺军团菌Mip序列分型研究

目的研究深圳市公共场所冷却塔水中嗜肺军团菌的基因特征。方法采用军团菌巨噬细胞感染力增强因子基因（Macrophage Infectivity Potentiator,mip）分型方法。提取深圳市51株嗜肺军团菌菌株DNA,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术扩增mip基因,并将PCR扩增产物进行测序。结果每菌株测序后,序列与European Working Group for Legionella Infections（E.W.G.L.I）组织建立的数据库进行比对。51株嗜肺军团菌分为5种型别,分别为L.pnuemophile-phil-1、L.pnuemophile-sg3、L.pnuemophile-D-15、L.pnuemophile-sg10与L.pnuemophile-97-2898。结论mip分型方法可用于嗜肺军团菌的基因分型。深圳各区不同场所冷却塔水中分离的嗜肺军团菌株之间存在差异,L.pnuemophile-phil-1型别为优势型别占60.8％。     

用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究

目的建立和评价直接用PCR从血标本中检测白色念珠菌核酸的方法。方法用红、白细胞裂解液、破壁酶和真菌DNA提取盒直接处理血标本,得到的微量靶DNA用白色念珠菌种特异性引物进行扩增。结果在白色念珠菌制备的人血标本中检测出靶DNA,其敏感性达10个孢子/ml以下,从处理标本到报告结果仅需6h。结论用PCR法可特异、敏感地从血标本中直接检测白色念珠菌核酸,有助于临床快速诊断深部白色念珠菌感染。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达

目的 探讨大肠杆菌中表达嗜肺军团菌的热休克蛋白60（HSP60）的表达。方法 利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增嗜肺军团菌HSP60基因，将其定向插入载体pUC18构建重组原核表达质粒，重组质粒转化到大肠杆菌JM109后IPTG诱导表达。并对其表达产物进行SDS-PAGE和Westem-blotting分析。结果 重组质粒在大肠杆菌中成功表达，可被抗军团菌抗血清识别。结论 HSP60基因可在大肠杆菌中表达。并有免疫原性。     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌所致社区获得性肺炎的临床对比分析

目的探讨嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌感染所致社区获得性肺炎的临床特点,提高对军团菌肺炎的认识。方法采用双重聚合酶链反应(DPCR)法对根据临床表现及血清抗体结果,临床诊断为军团菌肺炎患者的痰标本进行军团菌DNA检测。选择痰DPCR和血清抗体结果呈一致阳性的患者并根据检测结果将其分为嗜肺军团菌肺炎组(42例)和非嗜肺军团菌肺炎组(18例)。将2组患者的临床资料进行对比分析。结果痰标本DPCR结果与血清特异性抗体结果呈一致阳性,嗜肺军团菌肺炎与非嗜肺军团菌肺炎诊断明确。嗜肺军团菌肺炎多发于既往体健的青壮年,主要发病于夏秋季;非嗜肺军团菌倾向于四季散发,多发于有基础疾病的老年人。与非嗜肺军团菌肺炎相比,嗜肺军团菌肺炎患者的肺脏受累面积较大,胸腔积液及ARDS发病率高,同时全身感染中毒症状和肺外表现更为明显(P<0.05)。结论嗜肺与非嗜肺军团菌感染所致社区获得性肺炎临床特点有所不同,早期予大环内酯类/喹诺酮类抗生素治疗是改善预后的关键手段。     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白DNA疫苗的免疫保护性研究

目的观察m ompS基因DNA疫苗对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA 3.1-m ompS实验组股四头肌肌肉接种pcDNA 3.1-m om opS质粒100μg,两周后加强免疫1次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和空质粒,加强免疫后3周小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌L 1型菌液进行攻击感染,感染4周后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果pcDNA 3.1-m ompS免疫组肺组织带菌量少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.01);与生理盐水对照组和空质粒对照组比较,pcDNA 3.1-m ompS免疫组肺组织病理改变轻微。结论由m ompS基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

嗜肺军团菌PAL抗原基因的克隆及真核表达

目的 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL,并观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法.结论PCR扩增嗜肺军团菌PAL基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,将经酶切、PCR扩增及序列测定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-PAL.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞,经免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物.结果 重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞后获得了有效表达.结论 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础.     

嗜肺军团菌mip基因的原核与真核表达重组质粒的构建

目的　扩增嗜肺军团菌 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒 p L pmip和pc DNA3.1- mip。方法　采用 PCR从嗜肺军团菌扩增得到 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒p L pmip和 pc DNA3.1- mip并转化大肠杆菌 ,用限制性酶切分析、PCR、序列分析进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的 mip基因 ;构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。结论　成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌 Mip基因 ,构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。     

双重PCR法检测痰标本对早期诊断军团菌肺炎的意义

为探讨双重PCR方法 (DPCR)检测痰标本中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎方面的意义 ,采用DPCR方法对军团菌肺炎组、临床疑似军团菌肺炎组、普通肺炎组和肺结核组 4组患者留取的痰标本进行检测。DPCR过程采用根据军团菌 1 6SrRNA基因和mip基因设计的 2对引物 ,同时扩增军团菌 3 86bp 1 6SrRNA基因片段和 2 0 6bpmip基因片段。结果 :军团菌肺炎组的DPCR阳性检出率为 1 0 0 % ,明显高于其他 3组 (分别为 1 7.2 4%、0、0 ,P均 <0 .0 1 )。模拟痰标本DPCR的最低检出限为 1× 1 0 3 cfu/mL。初步研究表明 ,DPCR方法检测痰标本中的军团菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性 ,此法在临床早期诊断军团菌肺炎方面具有一定的价值