人脐带间充质干细胞在软骨组织工程中的应用

目的人脐带间充质干细胞是一成体干细胞,其具有自我更新及多向分化潜能的特点,而且对供者没有影响,所以具有丰富的来源。它还具有以下优点,如采集和运输方便,无异体排斥反应,无伦理争议等,在体外可成功诱导分化成软骨细胞,是软骨组织工程中理想的种子细胞。     

自体间充质干细胞构建组织工程骨修复人长骨缺损的临床观察

目的观察个体化组织工程骨用以修复患者长骨缺损的疗效与安全性。方法利用组织工程技术,通过抽取临床上骨源缺乏的患者少量骨髓分离出其中的人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell,hMSCs）,并在体外对其进行扩增培养并诱导分化后,与自制的同种异体脱钙骨基质相复合,构建个体化的组织工程骨并应用于临床,通过临床随访其放射学及血液学结果评价其疗效与安全性。结果30例个体化组织工程骨临床应用患者均达到随访半年以上,随访资料显示成骨速度及效果均与自体骨类似,且术后肝肾功、血沉等指标均无明显异常,最长随访达4年未发现病灶复发。结论由患者自体间充质干细胞构建的组织工程骨具有良好的生物安全性和成骨效能。     

组织块法分离人脐带间充质干细胞的研究

目的：应用组织块法分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）并对其生物学特性进行研究。同时探讨在不同储存条件下的脐带是否对组织块法的分离成功率产生影响。方法：无菌条件下采集足月儿的脐带,应用组织块法分离hUC-MSCs,通过流式细胞术观察其免疫学、生长特性。脐带在常温条件和冷冻条件下储存后进行组织块法分离,观察细胞生长情况。结果：应用组织块法能获得贴壁生长的hUC-MSCs,流式细胞仪分析结果显示细胞高表达常见MSC表面分子CD105、CD73及HLA-ABC;低表达造血细胞表面标记CD34、CD45及HLA-DR。常温储存条件下,随着处理时间的延长,获得原代细胞数量下降;组织冷冻后可以获得hUC-MSCs。结论：组织块分离法可以获得贴壁生长的hUC-MSCs,并成功传代扩增;脐带采集后24 h内处理,hUC-MSCs获得数量及分离成功率高;随着处理时间延长,hUC-MSCs获得数量减少,分离成功率降低。     

骨髓间充质干细胞复合壳聚糖凝胶体外构建可注射组织工程软骨

目的：探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建可注射型组织工程软骨的有效性和可行性。方法：骨髓间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠制成注射型细胞/凝胶复合物并行体外成软骨诱导培养,通过倒置显微镜、扫描电镜和组织学检查等观察细胞在凝胶内黏附、生长、增殖、向软骨细胞分化及形成软骨样组织等情况。结果：在体外成软骨培养条件下,壳聚糖凝胶支持骨髓间充质干细胞生长、增殖、向软骨细胞分化并形成软骨样组织。结论：骨髓间充质干细胞/壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶复合物,有望用作可注射型组织工程软骨修复软骨缺损。     

骨髓间充质干细胞在骨软骨缺损修复中的研究现状

随着细胞生物学和分子生物学的发展．近年来干细胞的生物学特性已成为医学研究领域的焦点。干细胞（stem cell，SC）是指具有自我复制能力及多向分化潜能的细胞。在体内和体外通过外界干预及环境的变化，可以分化成具有多种功能的细胞，干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞。     

同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究

目的：了解兔骨髓间充质干细胞（BMscs）同种异体移植的存活分布情况及同种异体兔BMscs复合胶原海绵（CS）情况,观察其对兔桡骨1.5 cm缺损的修复效果,为将来的进一步应用奠定实验基础。方法：采集、培养、纯化扩增新西兰大白兔BMscs,用eGFP荧光标记BMscs,与胶原海绵联合培养,植于同种异体动物臀大肌,观察存活及分布情况。建立兔桡骨缺损（1.5 cm）模型,45只新西兰大白兔随机分为3组：同种异体BMscs/CS组（A组）,单纯胶原海绵组（B组）,空白对照组（C组）。术后分阶段行X线、组织学检查及生物力学检查,评价其修复效果。结果：eGFP标记的BMscs异体移植存活时间超过3周。X线示12周A组大白兔5只中有4只达到骨性连接。新生骨量呈A组-C组递减,至12周无一愈合。随着时间推移,A组编织骨髓腔和骨小梁增多,修复过程优于B、C组。A组生物力学指标均低于健侧正常对照组,但各指标能达到正常组的80%～90%。结论：同种异体MSCs复合CS可以修复1.5 cm兔桡骨缺损。     

神经生长因子转染的人脐带间充质干细胞促进中枢神经系统损伤修复的实验研究

目的 探讨神经生长因子（NGF）转染的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）减轻中枢神经系统功能损伤和促进中枢神经系统功能恢复的可行性。方法 构建缺血、缺氧脑损伤的Wistar 大鼠模型，同时分离培养hUC-MSCs，并将腺病毒介导的NGF转染hUC-MSCs。将转染成功后的hUC-MSCs移植入大鼠模型中，饲养4 周后采用足印分析试验、平衡木试验分别对大鼠的运动功能进行评价。结果 流式细胞仪检测提示hUC-MSCs 分离培养成功，hUC-MSCs 可过表达NGF 蛋白。与hUC-MSCs 组比较，NGF-hUC-MSCs 组幼鼠右侧足印步态重复间距和平衡木通过时间均有统计学差异（均P＜0.05），左侧足印步态重复间距无统计学差异（P＞0.05）。结论 NGF 联合hUC-MSCs 移植能促进实验大鼠的运动功能恢复，为中枢神经系统损伤修复和并发症预防提供了新的途径。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

同种异体兔骨髓间充质干细胞复合纳米晶胶原基骨修复胫骨缺损的实验研究

目的探讨同种异体兔骨髓间充质干细胞（marrow mensenchymal stem cells，MSCs）与纳米晶胶原基骨（nano—hydroxyapatite／collagen，NHAC）修复材料构建的组织工程骨修复兔胫骨缺损的可行性。方法24只新西兰大白兔胫骨中段形成10mm长的骨缺损，右侧骨缺损处植入组织工程骨作为实验组，左侧骨缺损处植入单纯NHAC作为对照组。术后3、6、9、12wk分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、组织学染色分析等指标检测，行统计学分析，比较各组修复骨缺损的效果。结果24只新西兰大白兔均进入结果分析。①术后一般情况：各组兔术后恢复及进食均正常，伤口无炎症反应，愈合良好。②大体观察：实验组术后6wk骨缺损部分修复，9、12wk骨缺损完全修复，3、6、9、12wk骨缺损修复情况明显好于对照组。③X线：实验组缺损区术后3wk可见有骨痂生长，9wk骨缺损基本修复，对照组术后12wk缺损区基本修复，各观察时间点实验组骨缺损修复情况明显好于对照组。④组织学染色：实验组缺损区新生类骨样组织、编织骨和板状骨出现的时间较对照组早，并且不经软骨介导即可直接成骨，而对照组以“爬行替代”方式修复骨缺损。结论同种异体兔MSCs复合NHAC修复骨缺损的能力较单纯NHAC强且迅速，能够对大段骨缺损进行快速有效的修复。     

间充质干细胞修复骨缺损的研究进展

在可生物降解的支架材料上接种活细胞,用以植入体内完成组织修复与功能替代,是组织工程学的经典概念。其中种子细胞是骨组织工程研究的基础与首要环节,也是影响骨组织工程持续发展及产业化的瓶颈之一。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因具有来源充足、取材简便、能自我更新、     

修复骨缺损的脂肪干细胞组织工程材料的研究进展

脂肪干细胞(ADSCs)作为组织工程材料中最为重要的种子细胞,被广泛应用于骨缺损修复的实验研究中。单独应用脂肪干细胞,因其自身成脂特性较强,无法满足骨缺损修复的需要,通过复合不同因子及生物技术而制成的组织工程材料可以很好的解决这一问题。目前以ADSCs为“种子细胞”的骨组织工程支架种类繁多,但尚无文章进行总结。因此,本文总结近年来中外研究所报道的此类骨组织工程支架,并对其优缺点进行深入总结,为今后临床骨缺损的治疗提供依据。     

骨缺损修复过程中间充质细胞的成骨作用

[目的 ]探讨间充质细胞在骨缺损修复过程中的作用 .[方法 ]家兔双侧桡骨中段制成骨缺损后往左侧缺损区内植入自体红骨髓作实验组 ,右侧未植入移植物的作对照组 .术后第 3,5 ,7d和第 2 ,4周分期取材 ,通过光学显微镜、电子显微镜观察间充质细胞的动态变化 .[结果 ]术后第 7d ,两组新生血管周围未分化间充质细胞转化为成骨细胞 .第 2周 ,实验组成骨细胞变为骨细胞 ,而对照组细胞变化不明显 .第 4周 ,两组血管周围间充质细胞呈扁平形 ,胞质内细胞器稀少 .[结论 ]骨缺损修复过程中早期新生血管周围间充质细胞有成骨潜能 ,红骨髓对其成骨有明显促进作用 .     

兔骨髓基质干细胞复合珊瑚修复兔骨缺损的实验研究

目的：对天然珊瑚（natural coral，NC）的细胞相容性进行研究，观察其与兔骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells．BMSCs）复合后修复兔桡骨缺损的能力。方法：从兔股骨转子窝抽取骨髓，体外培养扩增，将其接种于珊瑚上，一组分别于1、3、7、14天取材，扫描电镜（SEM）观察细胞在支架上的生长情况，另一组进行诱导，培养5天后接种于兔桡骨1cm缺损中．以珊瑚填充桡骨缺损组作为对照。结果：从第1天开始，珊瑚表面即有细胞贴壁，随时间延长，细胞数量增多，到14天时有大量胶原形成。种植于兔桡骨缺损者4周时珊瑚降解不明显，骨组织形成较少，8周时见珊瑚部分降解．骨组织形成较多，20周时珊瑚完全降解，骨折愈合。结论：BMSCs与NC复合可构建组织工程骨，能修复骨缺损，并具有成骨可靠、来源广泛、成本低廉等特点．     

PHBHHx与人脐带间充质干细胞的体内异位成骨研究

目的：探讨以3‐羟基丁酸‐3‐羟基己酸共聚酯（PHBHHx）为支架材料,以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）为种子细胞的复合物体内构建组织工程骨的能力。方法将hUCMSCs接种在PHBHHx上体外成骨诱导培养2周,诱导组为实验组,不滴加hUCMSCs组为对照组,植入裸鼠皮下,并分别于1、3、5个月取材行HE、Ⅰ型胶原免疫组织化学、碱性磷酸酶染色及逆转录聚合酶链反应（RT‐PCR）检测。结果 PHBHHx表现出良好的细胞吸附性。实验组细胞大、小形态基本保持原状,成骨特异性指标检测均为阳性;对照组细胞则不能保持原状,体积逐渐缩小至完全降解,成骨特异性指标均为阴性。结论 PHBHHx复合hUCMSCs经体外成骨诱导后具有在裸鼠体内异位构建组织工程骨的能力。     

血管内皮祖细胞对组织工程骨成骨能力影响的实验研究

目的观察血管内皮祖细胞（EPCs）时组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺顿时成骨能力的影响。方法自体骨髓通过不同方法的体外培养，获得EPCs厦经成骨诱导的MSCs，与DBM构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损。观察术后不同时期的影像学及骨密度改变。结果术后2周，EPCs组与对照组的X线观察厦骨密度差异无统计学意义。术后4、8、12周，EPCs组的骨密度明显高于对照组，X线示EPCs组骨痂明显多于对照组，8周可见EPCs组髓腔部分再通，对照组髓腔尚封闭。12周EPCs组新生骨密度均匀，髓腔已完全再通，对照组新生骨仍可见部分低密度区，髓腔大部分再通。术后16周，两组骨密度差异无统计学意义，X线示EPCs组新生骨已基本完成塑形，对照组髓腔完全再通，新生骨处于重建塑形期。结论EPCs可以促进组织工程骨修复大段骨缺损时的成骨能力，加速骨愈合。     

异种骨复合自体骨髓基质干细胞修复节段性骨缺损

目的探讨异种骨复合骨髓基质干细胞(MSCs)修复节段性骨缺损的可行性。方法将MSCs与异种松质骨在体外联合培养,兔桡骨中上段制成1.5 cm的骨-骨膜缺损模型,实验组植入复合异种骨,对照组植入单纯异种骨,空白对照组不植入任何材料,分别于术后4、8、12周各时间点行标本的组织学观察、X线片观察、透射电镜观察及骨密度测试,比较其骨缺损区骨修复情况。结果术后第12周,实验组骨缺损区完全修复,骨密度接近正常;对照组骨缺损区修复缓慢,新骨形成量少;空白对照组骨缺损区未修复。结论异种骨复合MSCs修复节段性骨缺损能力强,在成骨速度和量上明显优于单纯异种骨。     

骨髓间充质干细胞培养液对牙周组织再生的影响

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）培养液对牙周组织再生的影响。方法 原代培养SD大鼠BMMSCs,取细胞培养液（conditioned media, CM）。采用ELISA检测培养液里与成骨相关的IGF-1、VEGF、PDGF-BB、BMP-2的含量;利用BMMSCs培养液对牙周膜细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）进行培养后,RT-PCR法检测PDLCs矿化相关基因核心结合因子2（Runx2）、骨桥素（OPN）、骨钙素（OCN）的变化;Western印迹法检测Runx2、OPN、OCN蛋白的表达变化。将BMMSCs培养液及种子细胞分别制备成凝胶,在大鼠左下第一磨牙颊侧及根分叉处制备牙周缺损,放入制备好的凝胶。分别在术后第4、8周,处死大鼠,取出左侧下颌骨,进行Micro-CT扫描及组织学分析。结果 BMMSCs培养液中含有大量IGF-1和VEGF;RT-PCR和Western印迹法均能检测到牙周膜细胞OPN、OCN、Runx2的表达,且利用BMMSCs培养液培养的PDLCs表达高于常规培养的PDLCs(P＜0.05)。8周时,BMMSCs培养液凝胶组相比于对照组生成了更多的牙槽骨(P＜0.05)。结论 同等条件下,BMMSCs培养液比种子细胞能更好地修复缺失的牙周组织。     

Ectopic osteogenesis and scaffold biodegradation of tissue engineering bone composed of chitosan and osteo-induced bone marrow mesenchymal stem cells in vivo

Background Chitosan （CS） scaffolds combined with osteogenically induced bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） have been proved to be promising substitutes for repairing bone defects.Nevertheless,the bone-forming and scaffold-biodegrading processes are seldom studied.This study aimed to determine the osteogenic ability of CS/osteoinduced BMSC composites by observing the bone-forming process and explore the relationship between bone formation and scaffold biodegradation.Methods The CS/osteo-induced BMSC composites （CS＋cells group） and the CS scaffolds （CS group） were,respectively,implanted into SD rat thigh muscles.At 2,4,6,8,and 12 weeks postoperatively,the rat femurs were scanned by CT,and the CT values of the implants were measured and comparatively analyzed.Subsequently,the implants were harvested and stained with hematoxylin and eosin and Masson trichrome,and the percentages of bone area,scaffold area,and collagen area were calculated and compared between the two groups.Results The imaging results showed that the densities of implants of the two groups gradually increased along with time,but the CT values of implants in the CS＋cells group were much higher than in the CS group at the same time point （P ＜0.05）.The histological results showed that the de novo bone and collagen formed in the pores of the scaffolds and gradually increased since 2 weeks postoperation in both groups,and the scaffold gradually degraded along with the boneforming process.However,the comparative analysis results showed that the CS＋cells group gained more de novo bone and collagen formation and had less scaffold than the CS group at the same time point （P ＜0.05）.Conclusion The CS/osteo-induced BMSC composites are excellent bone tissue engineering substitutes,and the scaffold biodegradation is accordant with the bone formation.     

血管内皮生长因子165基因修饰的人脂肪间充质干细胞与改性丝素蛋白体内构建血管化组织工程脂肪的研究

目的：探讨血管内皮生长因子165（VEGF165）基因修饰的人脂肪间充质干细胞（hADSCs）与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法分离提取hADSCs,选取生长状态良好的第3代hADSCs,用携带重组人VEGF165基因的慢病毒进行感染（感染复数=50）。选用慢病毒感染和未感染的第3代hADSCs分别接种于支架材料上,记为实验组与对照组,同时成脂诱导5 d后,使用氯甲基苯甲酰胺标记细胞。取24只雌性Wistar大鼠,将上述实验组与对照组细胞—支架复合物移植于背部皮下,每组12只。移植后8,12周分别取材并行冰冻切片、HE染色、油红O染色及扫描电镜,同时观察支架材料的降解情况,观察移植物。免疫印迹法检测VEGF165及过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2（PPARγ-2）蛋白的表达。结果移植后8,12周,免疫印迹法结果显示实验组移植物均表达VEGF165,对照组未见表达;实验组与对照组均表达PPARγ-2,实验组中的表达量明显多于对照组（P<0.05）。扫描电镜、油红O染色及HE染色均表明实验组与对照组生成大量脂肪样细胞,且实验组明显多于对照组（P<0.05）。结论携带重组人VEGF165基因的慢病毒感染的hADSCs与壳聚糖/丝素蛋白支架材料复合物在大鼠体内可持续表达VEGF165及PPARγ-2蛋白,能显著促进工程化脂肪组织的构建,为血管化组织工程脂肪的构建奠定了基础。     

Transfect bone marrow stromal cells with pcDNA3.1-VEGF to construct tissue engineered bone in defect repair

Background  We previously showed that nano-hydroxyapatite/carboxymethyl chitosan (n-Ha/CMCS) displayed excellent mechanical properties, good degradation rates and exceptional biocompatibility, with negligible toxicity. The aim of this study was to determine the effect of the same composite with vascular endothelial growth factor (VEGF)- transfected bone marrow stromal cells (BMSCs) in a rabbit radial defect model.

Methods  The nano-hydroxyapatite was produced through co-precipitation. The n-HA/CMCS scaffold was produced by particle filtration and lyophilization followed by genipin crosslinking. Total RNA from rabbit bone was reverse-transcribed to synthesize VEGF165-pcDNA3.1 that was transfected into the BMSCs. The composite was implanted into a rabbit radial defect model, and the osteogenic activity examined by gross morphology, X-ray examination and hematoxylin and eosin (HE) staining.

Results  The microstructure and mechanical property of the n-HA/CMCS scaffold resembled natural cancellous bone. Compared with glutaric dialdehyde crosslinked scaffolds, the genipin crosslinked scaffold was less toxic, and displayed a higher capacity to promote cell adhesion and proliferation. Spontaneous fluorescence of the composite permitted visualization of the composite-bone interface and the adhesion behavior of cells on the scaffold under laser scanning confocal microscopy. The scaffold with VEGF-transfected BMSCs bridged the bony defect and promoted healing, with most of the implanted material being replaced by natural bone over time with little residual implant. Using X-ray, we noted obvious callus formation and recanalization of the bone marrow cavity. Furthermore, HE stained sections showed new cortical bone formation.

Conclusions  The n-HA/CMCS scaffold composite with VEGF-trasnfected BMSCs is biocompatible, nontoxic, promotes the infiltration and formation of the microcirculation, and stimulates bone defect repair. Furthermore, the degradation rate of the composite matched that of growing bone. Overall, this composite material is potentially useful for bone defect repair.