Meprinα对TGF-β1诱导的成纤维细胞胶原合成的调节作用

目的观察Meprinα对转化生长因子(TGF)-β1介导的成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的调节作用。方法原代培养肺成纤维细胞,采用TGF-β1诱导,并予以重组Meprinα及放线酰胺素(Actinonin)预处理。免疫细胞化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫印迹法检测Meprinα、I型胶原、α-SMA的表达。结果 TGF-β1能够促进肺成纤维增殖和迁移能力,显著上调I型胶原、α-SMA的表达,同时降低Meprinα的表达(P<0.05)。免疫印迹结果显示,予以Meprinα预处理能够显著抑制TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05);予以Actinonin预处理,则能够显著促进TGF-β1介导的I型胶原、α-SMA表达的上调(P<0.05)。结论 Meprinα具有抑制TGF-β1介导的肺成纤维细胞胶原合成和肌成纤维细胞分化的作用。     

TGF-β_1与α-SMA在小鼠肺纤维化模型中的表达及其相互关系

目的探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在小鼠肺纤维化模型中的表达,及其之间的相互关系。方法气管内灌注博莱霉素(7 mg/kg)制备肺纤维化模型,进行HE、Masson染色并采用免疫组织化学检测小鼠肺纤维化组织中TGF-β_1和α-SMA的表达。结果对照组中α-SMA表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞,模型组中α-SMA表达于支气管、大血管周围的平滑肌细胞及成纤维细胞灶,TGF-β_1表达于支气管、大血管周围的成纤维细胞、炎细胞以及成纤维细胞灶,与α-SMA表达相似。TGF-β_1和α-SMA均与小鼠肺纤维化程度均呈正相关(r=0.628、0.766,P0.01)。TGF-β_1与α-SMA呈正相关(rs=0.728,P0.01)。结论 TGF-β_1和α-SMA在肺间质纤维形成过程起到重要作用,并可能协同参与。     

青蒿琥酯对转化生长因子-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化中Notch1信号通路的影响

目的 探讨青蒿琥酯在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的原代肺成纤维细胞分化过程中的作用及其可能机制.方法 采用酶消化法及组织贴块法提取原代肺成纤维细胞,免疫荧光检测Vimentin的表达鉴定细胞;CCK法检测青蒿琥酯半数抑制浓度(IC50),根据IC50选择药物干预浓度.无血清同步化培养细胞分为4组:对照组(无血清培养基);TGF-β1诱导组(TGF-β15 ng/mL);青蒿琥酯干预组(TGF-β1 5 ng/mL+青蒿琥酯8μg/mL);青蒿琥酯对照组(青蒿琥酯8μg/mL).培养24 h后,Masson染色检测细胞及胶原分泌情况,Western blot 检测各组Notch1、Jagged1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况.结果 青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞24 h的IC50为8.56μg/mL;Masson染色示TGF-β1诱导组胶原的表达明显高于对照组,而青蒿琥酯干预组胶原的表达较TGF-β1诱导组明显减少.在TGF-β1诱导组,与对照组比较,Notch1、Jagged1、α-SMA的表达明显升高(P＜0.05);青蒿琥酯干预组Notch1、Jagged1、α-SMA表达较TGF-β1诱导组均明显减少(P＜0.05).结论 青蒿琥酯能抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞分化过程,其机制可能为抑制Notch信号的表达.     

TGF-β1对瘢痕成纤维细胞α-SMA表达的诱导作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对瘢痕成肌纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的诱导作用.方法以5例增生性瘢痕为标本,3例正常瘢痕为对照,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察了在不同TGF-β1浓度条件作用下,来源于增生性瘢痕和正常瘢痕的成纤维细胞表达α-SMA的情况.结果①不同浓度的TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ug/L的TGF-β1作用最有效;②与来源于正常瘢痕的成纤维细胞相比,来源于增生性瘢痕的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感.③对同一瘢痕来源的成纤维细胞而言,三维培养体系中α-SMA的含量要明显低于二维培养体系.结论①在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成肌纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;②增生性瘢痕中成纤维细胞与正常瘢痕中成纤维细胞性状存在着差异,对TGF-β1敏感性不同;③细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少.     

地中海贫血的基因诊断及DNA甲基化转移酶在地中海贫血发病机制中作用的研究

目的 探讨DNA甲基化转移酶l、3a、3b在地中海贫血发病机制中的作用.方法 通过基因诊断检测确诊为地中海贫血患儿,采用实时荧光定量技术检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在50例地中海贫血(以下简称地贫)患儿、35例正常儿童及32例非地贫贫血儿童中的表达.结果 (1)本研究50例地贫中,α-地中海贫血患儿9例,β-地中海贫血36例,αβ复合型地贫患儿5例,提示该地区β-地中海贫血的发生率高于α-地中海贫血.(2)对50例地中海贫血患儿、35例正常对照组儿童及32例非地贫贫血组儿童标本RT-PCR检测3种甲基化转移酶的表达,显示地中海贫血患儿中DNMT3a、DNMT3b的表达值明显高于正常对照组及非地贫贫血组(P＜0.05);DNMT1的表达与正常对照组及非地中海贫血贫血组相比,无显著性差异(P＞0.05).结论 地中海贫血基因诊断方法高效、准确、成熟可靠,可广泛推广于临床应用,DNA甲基化转移酶对于早期诊断地中海贫血有重要的参考价值,可作为早期诊断的有效指标.     

bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

转化生长因子β1诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化的机制研究

目的:探讨TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞(FB)向肌成纤维细胞转分化的可能途径和调控机制.方法:将野生型和Smad3基因敲除(KO)型小鼠皮肤FB分为9组:野生型FB组、野生型FB TGF-β1组、野生型FB SB431542组、野生型FB SB431542 TGF-β1组、Smad3 KO FB组、Smad3 KO FB TGF-β1组、野生型FB SB203580 TGF-β1组、野生型FB PD98059 TGF-β1组和野生型FB SP600125 TGF-β1组.各组细胞经同步化处理后,直接以TGF-β1刺激或经上述各激酶抑制剂预处理后再以TGF-β1刺激.收集细胞,一部分以单细胞RT-PCR检测α-SMA阳性表达百分比,另一部分细胞抽提总RNA后采用实时荧光定量RT-PCR检测α-SMA的表达水平变化.结果:Smad3 KO组与SB431542组的α-SMA表达水平和阳性百分比显著升高(Smad3 KO FB组vs野生型FB组;野生型FB SB431542 TGF-β1组vs 野生型FB SB431542组;Smad3 KO FB TGF-β1组vs Smad3 KO FB组,P＜0.01),而SB203580组和SP600125组中α-SMA表达水平和阳性百分比升高的作用则被显著抑制(野生型FB SB203580 TGF-β1组、野生型FB SP600125 TGF-β1组vs 野生型FB TGF-β1组,P＜0.05).结论:在TGF-β1诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化过程中,Smad3途径介导抑制作用,而p38/MAPK、JNK/MAPK途径则介导正向调节作用.     

PDTC对TGF-β_1诱导的大鼠纤维化肺成纤维细胞转分化的影响

目的:通过核因子-κB(NF-κB)抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)探讨NF-κB对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞转分化的影响。方法:采用体外细胞培养,免疫细胞化学技术,流式细胞术等技术,检测PDTC对TGF-β1诱导的成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。结果:TGF-β1诱导肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞(MF),表达α-SMA增强(P<0.05),PDTC抑制了TGF-β1的诱导作用(P<0.05),单独应用PDTC对肺成纤维细胞转分化无影响。结论:NF-κB促进TGF-β1诱导肺纤维化模型中肺成纤维细胞转分化成MF。     

ERK5对人肺成纤维细胞自噬、凋亡和增殖的调控

目的 探讨细胞外信号调节蛋白激酶-5(ERK5)对人肺成纤维细胞系(HLFs)自噬、凋亡和增殖的调控及对成纤维细胞表型转化的影响.方法 转化生长因子β1(TGF-β1)诱导HLFs建立肺纤维化细胞模型,过表达ERK5基因(ERK5)后通过Western blot检测自噬、凋亡、增殖相关因子和表型转化标志因子α-SMA的表达,通过细胞增殖/毒性检测(CCK8)试剂盒检测细胞增殖率.结果 经TGF-β1处理后,与对照组相比,ERK5组细胞α-SMA、P62蛋白表达水平升高,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平降低;促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原PCNA表达水平升高,CCK8检测到细胞增殖率升高.结论 在TGF-β1诱导的HLFs表型转化过程中,ERK5高表达促进细胞增殖、抑制细胞自噬和凋亡.     

阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导肾成纤维细胞表型活化的影响

目的 观察阿魏酸哌嗪对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾成纤维细胞表型活化的影响,探讨其抗肾间质纤维化的可能机制.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F),利用MTT观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞活力的影响;免疫细胞化学法观察阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达的影响;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞α-SMA及CTGF mRNA表达的作用,双抗体夹心ABC-ELISA法检测阿魏酸哌嗪对TGF-β1诱导细胞上清Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响.结果 TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力,上调细胞α-SMA、CTGF蛋白和mRNA的表达以及Col Ⅰ、FN的表达.与TGF-β1刺激组相比,阿魏酸哌嗪能部分抑制TGF-β1诱导的细胞活力增加、α-SMA、CTGF的表达和细胞外基质(ECM)的合成.结论 阿魏酸哌嗪可以在一定程度上拮抗TGF-β1诱导的肾纤维化效应.