改良法分离大鼠IOUs构建小肠的初步研究

目的采用改良方法分离大鼠小肠上皮类器官单位(IOUs),鉴定IOUs裸鼠体内发育能力.方法取出生5～8 d大鼠的小肠组织,采用改良分离法获得IOUs,与细胞外基质胶混合后植入裸鼠皮下,定期取材,组织学鉴定.结果采用改良方法分离时间明显缩短,体内植入所有实验组均有多个囊泡样组织形成,植入2周后部分囊腔凹陷可见隐窝样结构,2周后部分囊泡内壁可见分化较成熟的上皮细胞突出,类似绒毛结构;上皮下可见少量平滑肌样细胞围绕囊状管腔周围.结论初步证实改良方法分离出IOUs用于组织工程肠管构建的可行性,并为出生后组织修复重构的研究奠定了基础.     

大鼠骨髓内皮祖细胞移植到裸鼠体内的分化

目的:研究骨髓内皮祖细胞(EPCs)在裸鼠体内分化情况,进一步揭示其生物学特性。方法:密度梯度离心法分离大鼠骨髓EPCs;Hoechst33342标记原代(第10天)的EPCs注射到裸鼠背部两侧皮下,观测注射部位的变化及生成物的大小;移植第50天,剥离EPCs形成的皮下肿物,HE及免疫荧光染色,检测细胞CD31、Flk1、CD34的表达情况。结果:裸鼠皮下接种EPCs第20天,形成(0.13±0.018)cm2球形皮下肿物,逐渐增大,第40天开始处于生长平台期;HE染色组织内有管腔样结构、肌肉样组织及脂肪样细胞,同视野荧光显微镜下可见Hoechst标记的细胞;免疫荧光检测显示,Hoechst标记细胞抗原CD31、Flk1、CD34表达阳性。结论:大鼠骨髓EPCs移植到裸鼠体内一部分分化为内皮样细胞,并形成管腔样结构,另一部分分化为非内皮系细胞。     

体内成骨过程中人脂肪基质细胞对新骨形成的促进作用

目的：探索以人脂肪基质细胞（human adipose derived stromal cells,hASCs）为基础的组织工程骨在体内成骨过程中hASCs发挥的作用,为深入研究其体内成骨机制奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,进行传代培养。体内实验使用16只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：(1)空白;(2)单纯β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate, β-TCP）支架（支架对照组）;(3)β-TCP支架+人成纤维细胞（阴性细胞对照组）;(4)β-TCP支架+hASCs（实验组）。植入后1周、2周、4周、6周进行取材,每时间点取4只裸鼠,其中2只裸鼠的标本经处理后进行扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察,另外2只裸鼠的标本制成组织学切片,进行HE染色分析。结果：SEM观察可见实验组植入2周后,hASCs周围即出现大量细胞外基质,至4周时细胞外基质开始出现明显的矿化,6周时可见矿化基质进一步增多。HE染色分析可见实验组植入2周后hASCs即开始分泌嗜酸性较强的均质细胞外基质,至4周时细胞外基质中出现了强嗜酸性的类骨组织,6周时新生类骨组织面积明显增大,结构更加典型。在其他组均未见矿化基质和类骨组织生成。结论：人脂肪基质细胞在体内成骨过程中发挥了关键的作用,包括分泌大量细胞外基质,促进细胞外基质矿化和引导新生类骨组织形成。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞(cranial neural crest stem cell,CNCSC)后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化,探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC,体外经成纤维生长因子8(FGF8)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后,与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下,免疫组织化学方法检测型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达,鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为型胶原及DSPP阳性表达,2月后DSPP表达增强,局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布,并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化,为进一步开展牙再生研究奠定了基础。     

颅神经嵴干细胞成牙本质样细胞分化诱导的体内实验研究

目的观察诱导颅神经嵴干细胞（cranial neural crest stem cell，CNCSC）后的裸鼠体内成牙本质样细胞表型分化，探讨CNCSC用于牙再生研究的可行性。方法颅神经管组织块无血清条件培养法获取CNCSC，体外经成纤维生长因子8（FGF8）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、转化生长因子β1（TGFβ1）、牙本质基质非胶原蛋白等因子诱导后，与胶原-壳聚糖三维凝胶支架复合植入裸鼠背部皮下，免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白（DSPP）表达，鉴定其成牙本质样细胞表型分化特征。结果诱导后CNCSC植入体内后1月表现为Ⅰ型胶原及DSPP阳性表达，2月后DSPP表达增强，局部区域可见极性栅栏状排列的细胞分布，并可见明显的细胞外基质形成。结论CNCSC在体内可向成牙本质样细胞表型分化，为进一步开展牙再生研究奠定了基础。     

组织工程牙胚异体异位发育的实验研究

目的比较组织工程牙胚在体内不同部位移植的生长与发育情况,为进一步明确组织工程化牙齿的体内构建探寻合适的生长环境。方法采用出生后大鼠/猪第一磨牙牙胚为种子细胞,与不同生物材料相复合构建组织工程牙胚,分别植入裸鼠皮下、猪肠系膜内、SD成年大鼠肾被膜下,特定时间点取材,HE染色观察移植牙胚的发育情况。结果移植于裸鼠皮下、肠系膜内的移植物未见进一步发育趋势,皮下构建的组织工程牙胚部分从皮肤脱落而丧失,在肠系膜内可见大量浸润的淋巴细胞;而移植于大鼠肾被膜下的牙胚生长良好,可见釉质和牙本质-牙髓复合体。结论肾被膜下的种植环境有利于异体组织工程牙胚的生长,可为牙齿体内组织工程化方式及进一步发育提供良好的微环境。     

组织工程牙胚异体异位发育的实验研究

目的比较组织工程牙胚在体内不同部位移植的生长与发育情况，为进一步明确组织工程化牙齿的体内构建探寻合适的生长环境。方法采用出生后大鼠／猪第一磨牙牙胚为种子细胞，与不同生物材料相复合构建组织工程牙胚，分别植入裸鼠皮下、猪肠系膜内、SD成年大鼠肾被膜下，特定时间点取材，HE染色观察移植牙胚的发育情况。结果移植于裸鼠皮下、肠系膜内的移植物未见进一步发育趋势，皮下构建的组织工程牙胚部分从皮肤脱落而丧失，在肠系膜内可见大量浸润的淋巴细胞；而移植于大鼠肾被膜下的牙胚生长良好，可见釉质和牙本质-牙髓复合体。结论肾被膜下的种植环境有利于异体组织工程牙胚的生长，可为牙齿体内组织工程化方式及进一步发育提供良好的微环境。     

微球化骺板细胞构建兔异位骺软骨实验

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸微球复合骺板细胞,在兔体内异位构建组织工程化骺软骨的可行性。方法将兔异体骺板软骨细胞接种于海藻酸钙-赖氨酸凝胶微球中,体外培养后植入兔背部皮下,分别于2、4、8周取材进行大体及组织学观察。结果体外培养时微球中骺板细胞生长、增殖情况良好;移植皮下后第4周取材可见外形呈类骺软骨样组织块,行HE、甲苯胺蓝、番红“O”及Ⅱ型胶原等染色,镜下观察可见大量软骨细胞及类软骨陷窝样结构,植入的海藻酸钙微球周围组织无明显炎症反应。结论海藻酸钙-赖氨酸具有良好的组织相容性,复合异体骺板细胞形成微球,植入同种异体动物体内可以构建类骺软骨样组织。     

hVEGF基因修饰的SD大鼠BMSCs与胶原膜BME-10X复合物的成骨能力研究

目的：观察人血管内皮生长因子（hVEGF165）基因的骨髓基质细胞（BMSCs）与胶原膜BME‐10X复合的相容性及该复合物移植在体内的成骨情况,为其能否修复牙周骨质缺损提供依据。方法在体外将hVEGF165基因转染的SD大鼠BM SCs种植于胶原膜BM E‐10X复合膜上,使用激光共聚焦扫描显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及组织学方法进行观察,并将该复合物植入裸鼠皮下,于4、8周处死裸鼠取材制成组织切片,H‐E染色后观察异位体内成骨和血管生成的情况。结果复合物培养24 h后见目的细胞在胶原膜中贴附、伸展,各层BM E‐10X胶原膜上均有数量不等的细胞附着。转染细胞在胶原膜表面复层生长,并进入内部间隙中。复合物植入裸鼠皮下后,可见新生胶原纤维、类骨质样结构和新生血管的形成。结论 hVEGF165基因转染 BMSCs 在胶原膜BM E‐10X上生长良好,细胞‐胶原复合物在裸鼠体内具有异位成骨及促进新生血管形成能力。     

毛囊细胞移植诱导裸鼠毛囊样结构形成的研究

目的:观察毛囊细胞移植诱导裸鼠毛发再生和毛囊重建情况.方法:采用细胞培养技术和裸鼠移植技术,将培养的毛囊毛乳头细胞、真皮鞘细胞和头皮真皮成纤维细胞按比例与毛囊上皮细胞混合,移植到裸鼠皮下,观察毛囊形成情况.结果:在毛囊毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合后移植到裸鼠皮下后可见毛囊样结构形成,而毛囊真皮鞘细胞和头皮成纤维细胞与毛囊上皮细胞混合则不能诱导裸鼠毛囊样结构形成.结论:低传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合后在体内可诱导毛囊样结构形成.     

高孔隙率滨珊瑚用于组织工程骨的构建

目的 探讨西沙群岛高孔隙率滨珊瑚作为骨组织工程支架材料的可行性，为组织工程研究开辟新的途径。方法 取4wk龄兔骨髓,分离骨髓基质细胞，体外培养，经诱导分化为成骨细胞，接种至滨珊瑚材料，无菌条件下植入裸鼠皮下组织中，对照组单纯植入滨珊瑚。分别于4，8wk取材，行大体观察、X线摄影及组织学染色，观察新骨形成情况。结果 4wk时X线片有高密度阻射影像，HE染色可见有新骨形成；8wk时X线阻射影像密度更高，HE染色可见大量新骨形成并相互连接成骨小梁样结构，骨细胞位于陷窝中。结论 高孔隙率滨珊瑚可以作为骨组织工程的支架材料并有广阔的应用前景。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨方向的诱导分化及体内应用

目的：研究经矿化诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSC)在裸鼠体内的成骨潜能。方法：分离并培养兔MSC,矿化诱导,观察MSC的形态学改变及碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导后的MSC-去抗原牛松质骨复合体植入裸鼠背部皮下,3 d后取材,行组织学观察。结果:经矿化诱导后,MSC的形态由长梭形向多角形和三角形转化,ALP组织化学染色阳性,活性明显增高。MSC-去抗原牛松质骨复合体植入裸鼠后3 d,组织学见细胞均匀贴附于骨小梁表面,伸展良好,未见未贴壁细胞及外源性纤维组织、血管长入。结论：经矿化诱导的MSC向成骨细胞方向分化和增殖,经观察MSC-去抗原牛松质骨复合体在裸鼠体内可成活并增殖。     

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的:观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能. 方法:获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架. 支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下,支架单纯植入作为对照. 植入后3, 6 wk取材,通过大体、组织学观察评价成骨活性. 结果:支架/细胞复合物植入后3 wk,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成;植入后6 wk,更多的成熟骨形成. 在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞,部分区域有血管和多核巨细胞分布,可见软骨内成骨方式. 结论:支架/细胞复合物显示良好的成骨活性,鸵鸟羟基磷灰石陶瓷可以用于骨组织工程支架材料.     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

In vivo chondrogenesis of induced human marrow mesenchymal stem cells in nude mice]

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of generating cartilage tissues from human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured and induced in vitro using tissue engineering technique. METHODS: Human bone marrow MSCs were isolated from the ribs of patients receiving chest surgeries and induced into cartilage cells in serum culture-free medium. The cells were then seeded on perchloroethylene (PCE) as the scaffold material for the formation of cell-PCE composite, which was implanted under the dorsal skin of nude mice. Specimens of the implants were harvested 6 weeks after implantation and subjected to gross morphological observation and histological examination. RESULTS: Gross observation showed subcutaneous lump with considerable tenacity, and histologically, large amount of cartilage cells in clusters were seen to have evolved, in the presence of some scaffold material failing to be degraded, indicating that cartilage formation from the MSCs occurred approximately 6 weeks after the implantation of the induced MSCs. CONCLUSION: Human MSCs can be induced into chondrocytes in vitro, and the MSC-PCE composite possesses the potential to develop into cartilage in nude mice. Human MSCs can therefore be used as the seed cells to construct tissue-engineered cartilage.     

立体定向大鼠脑内SHG-44人脑胶质瘤模型的建立

目的：探讨建立大鼠SHG-44脑胶质瘤模型的方法。方法：选用雄性Wistar大鼠,接种前连续3 d用地塞米松1 mg/100 g体重灌胃;在立体定向条件下选取大鼠脑右侧尾状核区为靶点,接种2×10⁵个处于对数生长期的SHG-44细胞,接种后观察大鼠生长状态,分别于第1、2周进行核磁共振(MRI)检查。在实验第2周时解剖标本,行组织病理和GFAP免疫组化检查。 结果：接种1周后核磁共振检查,脑内形成实体瘤;HE染色组织病理证实是胶质瘤,GFAP免疫组化阳性;成瘤率约60%。 结论：用预先免疫抑制的方法,成功建立了大鼠脑内人胶质瘤模型。     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的建立

目的:探讨建立人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的方法. 方法:培养人胚胎型横纹肌肉瘤细胞株RD细胞,取对数生长期细胞分别接种于4周龄SCID鼠和60Co照射 (1 Gy) 后1 d 的BALB/c裸小鼠;选用成瘤BALB/c裸小鼠的瘤块移植入另一批4周龄BALB/c裸小鼠胁部皮下(组织块接种法).观察各组动物肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织行常规病理H-E染色并镜检. 结果:60Co照射后1 d裸小鼠成瘤时间约6～8周,SCID鼠组约3～4周,组织块接种法移植2周后裸小鼠瘤体较明显,3组动物的成瘤率均为100%;成功绘制出肿瘤生长曲线,肿瘤均呈进行性生长;病理检查示各组移植性横纹肌肉瘤与人体肿瘤标本所见类似.结论:成功建立了裸小鼠和SCID鼠人眼眶横纹肌肉瘤模型,组织块接种法可以缩短BALB/c裸小鼠成瘤时间,为进一步研究人眼眶横纹肌肉瘤奠定了基础.     

犬牙周膜细胞与骨髓基质细胞组织再生能力比较的实验研究

目的 比较犬骨髓基质细胞(BMSC)和牙周膜细胞(PDLC)体内成骨及成韧带样组织的能力,为牙周组织工程种子细胞的选择提供实验依据. 方法 将体外培养Beagle犬BMSC及PDLC与脱细胞真皮基质(ADM)膜复合后植入裸鼠皮下,以单纯ADM为对照组,分别于术后4周和8周进行标本组织学及免疫组织化学染色分析,比较骨保护素(OPG)和胶原Ⅻ的表达. 结果 复合物植入4周和8周组织学观察显示,BMSC形成骨样组织多于PDLC,面形成韧带样组织少于PDLC.免疫组织化学染色显示,BMSC组的OPG表达量高于PDLC组,但胶原Ⅻ的表达量低于PDLC组. 结论 BMSC体内成骨能力高于PDLC组,但成韧带样组织能力低于PDLC组.     

培养鼠心肌细胞在移植大鼠体内生长发育的初步观察

目的：观察移植心肌细胞在成年大鼠心肌组织内生长发育过程中的形态学变化及其与宿主心肌相互作用情况。方法：将培养的F344近交系乳鼠的心肌细胞,经胶体金标记后,直接注入F344大鼠的心肌组织,8周内分别分批取标本,进行组织学和电镜观察。结果：与移植10d后的结果相比,4周后移植细胞明显体积增大,成熟度增加,并在移植细胞与主细胞间见润盘,缝隙连接及桥粒。在8周后的心肌组织切片中,移植心肌细胞的排列方向发生了变化,细胞排列与宿主心肌纤维的方向平行。结论：移植的心肌细胞在受体心肌内可以继续生长发育,并逐渐分化成熟;移植细胞与受体心肌细胞间可以形成功能性合胞体并能产生与宿主心肌纤维方向一致的收缩活动。