蛇足石杉内生真菌DSJ5的分离及其代谢产物HPLC-DAD筛选研究

目的:从蛇足石杉中筛选分离能产生生物活性物质石杉碱甲及其类似物的内生真菌。方法:从蛇足石杉新鲜植株中分离纯化内生真菌,采用HPLC-DAD筛选内生真菌的代谢产物。结果:内生真菌DSJ5代谢产物的色谱峰与石杉碱甲在相同的色谱条件下保留时间相同,且紫外光谱相近;DSJ5经形态特征鉴定为胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioide。结论:HPLC结合紫外光谱特征可用于检测内生真菌中微量的代谢产物;蛇足石杉内生真菌DSJ5可能产生石杉碱甲。     

产生物碱和石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的初步研究

 目的 筛选产生物碱和石杉碱甲的内生真菌。方法 以分离自健康蛇足石杉植株组织中的14株内生真菌为材料,采用酸性染料比色法筛选产生物碱的菌株;在此基础上,对内生真菌发酵液进行HPLC测定,分析是否产生石杉碱甲;并利用形态学和rDNA ITS序列分析进行菌种的初步鉴定。结果 筛选出8株产生物碱的菌株,并从中筛选出一株产生石杉碱甲的内生真菌SY-02,初步鉴定内生真菌SY-02为1株炭角菌。结论 在分离自蛇足石杉的内生真菌中,能产生生物碱的真菌比例较高,内生真菌菌株SY-02能在发酵条件下产生石杉碱甲。以产生物碱的菌株为出发菌株,结合活性及结构检测,可以使产石杉碱甲内生真菌的筛选更具有方向性。     

射干内生真菌Fusarium proliferatum的ISSR和SRAP位点遗传多样性分析

目的为了解射干内生真菌Fusarium proliferatum的遗传多样性。方法选用了52条ISSR引物和90条SRAP引物对17株射干内生真菌F. proliferatum进行了遗传多样性分析。筛选出了27条ISSR引物和38条SRAP引物可用于遗传多样性分析。结果结果,27条ISSR引物共扩增出了178个条带,其中131条(63%)具有多态性;38条SRAP引物能够扩增出357条稳定性较好的条带,其中323条(91%)具有稳定性差异。27条ISSR引物PCR扩增产物的多态性信息量(PIC)介于0.19～0.91,平均为0.70;38条SRAP引物PCR扩增产物的多态性信息量PIC介于0～0.93,平均为0.73。聚类分析结果表明,根据27个ISSR、38个SRAP及ISSR+SRAP遗传位点分析得出遗传相似系数变化范围分别为0.73～0.99、0.72～0.95和0.73～0.95,平均分别为0.84、0.85和0.85。根据材料间的遗传相似系数聚类,三者之间的聚类有较小的差异,但总体上,17株内生真菌被聚为3大类,分离自根的内生真菌F. proliferatum聚为一类,分离自茎和叶的F. proliferatum聚集于另外两类。研究表明,内生真菌F. proliferatum遗传相似性较大,其亲缘关系较近,与传统方法鉴定出的结果一致。结论采用分子标记技术比传统的方法鉴定更为有效,同时,ISSR和SRAP标记可更真实地反映射干内生真菌F. proliferatum的遗传多样性,为该内生真菌在分子生物技术方面的研究等提供一定参考。     

HPLC法测定6种石杉科植物中石杉碱甲的含量

目的 测定6种石杉科植物中石杉碱甲的含量。方法 用2％酒石酸溶液提取总碱，HPLC法测定，外标法定量。结果 石杉碱甲在所测定的5种石杉科植物蛇足石杉、皱边石杉、四川石杉、金丝条马尾杉、柳杉叶马尾杉中均有较高分布，分别达到0．0481％，0．0579％，0．0706％，0．0345％，0．1961％，在闽浙马尾杉中含量较少，仅为0．0061％。结论 方法简便、准确，可用于石杉碱甲资源的寻找。     

不同产地皱边石杉中石杉碱甲的含量研究

目的 :采用HPLC测定湖南不同产地皱边石杉中的石杉碱甲含量。方法 :采用NovapakC18柱 ( 5 μm ,15 0mm×4 .6mm) ,流动相 :甲醇∶水 ( 4 0∶6 0 ) ,流速 :1mL·min-1,检测波长 :315nm。结果 :石杉碱甲在 4 .2～ 2 1μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系 ,桑植产皱边石杉中石杉碱甲含量最高。结论 :皱边石杉中石杉碱甲的含量随着外界环境的改变而改变 ,所建立的HPLC方法快捷、灵敏、准确。     

湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究

 目的测定湖南产6种(含一新种)石杉属植物中石杉碱甲含量,为科学利用该植物提供可靠依据。方法于该省野外实地采集石杉属植物,以2%酒石酸溶液提取总碱,用改进的高效液相色谱法测定石杉碱甲的含量(外标法)。结果所采集6种石杉属植物中,石杉碱甲在蛇足石杉、狭叶石杉、长柄石杉、四川石杉、湖南石杉(拟新种)中均有分布,长柄石杉中含量最高,达0.0789%;本实验证明皱边石杉中不含石杉碱甲,先前两篇高含量报道应为鉴定之误。结论本测定方法简便、准确;在该属中4种形态极难区分的种之间,石杉碱甲含量具有分类学意义。     

三种千层塔中石杉碱甲含量测定

目的:通过用HPLC法测定恩施三种千层塔中石杉碱甲的含量。方法:取湖北恩施三种千层塔粉碎后用索氏提取和超声提取联用的方法提取试样,以HPLC法测定其产品中石杉碱甲的含量。色谱柱为Phenomenex C18(250mm×4.6mm,10μm);流动相:乙腈-醋酸铵(88∶12);流速:1mL/min;检测波长310nm。结果:恩施三种千层塔中石杉碱甲其蛇足石杉含量最高,四川石杉其次,皱边石杉含量最低。     

超声波提取蛇足石杉内生真菌2F09P03B中石杉碱甲的研究

 目的确定一株蛇足石杉内生真菌2F09P03B发酵培养物中石杉碱甲的超声波辅助提取工艺,以改善石杉碱甲提取率。方法对提取溶剂、pH值等影响提取效率的因素分别进行单因素实验;对料液比、超声波功率、负载率(dutycycle)、超声时间4个影响超声波提取效率的因素在单因素实验基础上利用正交实验进行优化。结果超声波辅助提取石杉碱甲的最佳工艺条件是:提取溶剂为pH4.0的酸水,碱性还原反应在pH7.5～8.0进行,料液比1:20,超声波功率140W,超声波负载率30%,超声时间40min。此条件下,该内生真菌石杉碱甲的提取率达0.074%,约为其他传统提取方法的1.5～2倍。结论超声波辅助提取法的石杉碱甲提取率较其他方法有了显著提高,并能大幅度缩短提取时间,应在蛇足石杉内生真菌2F09P03B石杉碱甲的提取中加以应用。     

药用真菌蛹虫草遗传多样性的SCoT分析

目的:研究药用真菌蛹虫草的种质资源遗传多样性。方法:采用非加权平均距离聚类法(UPGMA)结合主坐标分析法(PCoA)对27株不同来源的蛹虫草菌株的SCoT分子标记条带进行研究。结果:从36个引物中筛选出8条重复性好、条带清晰的引物进行PCR扩增,共扩增出59条条带,其中55条具有多态性,多态性比率为94.33%,平均多态性条带数为6.875。经NTSYSpc软件分析,27株蛹虫草菌株间的遗传相似系数在0.383~0.933之间,说明SCoT标记能够揭示蛹虫草种质间较高的遗传多样性。通过UPGMA法和PCoA法分析,27株蛹虫草分别分成6组和3组,菌株的遗传多样性与其来源有一定的相关性。结论:SCoT分子标记适用于药用真菌蛹虫草种质资源的多样性研究。     

薄层扫描法测定皱边石杉中石杉碱甲的含量

目的采用薄层扫描法测定皱边石杉Huperzia crispata(Ching ex H. S. Kung)Ching中石杉碱甲的含量.方法使用硅胶G薄层板,展开剂为氯仿-甲醇-氨水(610.1),0.1%高锰酸钾水溶液喷雾显色,于365 nm紫外光下检视,双波长锯齿扫描,检测波长301 nm,参比波长350 nm.结果石杉碱甲的线性范围为0.63~1.89 μg,平均回收率99.14%,RSD=3.42%.结论本方法简便、快速、准确,可用于石杉碱甲的含量测定及定性检测.     

美登木内生真菌产抗癌物质球毛壳甲素的分离及鉴定

目的 通过植物内生真菌的分离，筛选产生抗癌成分的菌株。方法 从美登木（Maytenus hookeri）茎、叶中分离内生真菌，对其发酵产物经活性跟踪（抑菌实验），其活性成分用薄层色谱、柱色谱纯化及活性跟踪，再经质谱及核磁共振光谱分析确定结构。结果 从美登木中分离筛选到一株球毛壳菌（Chaetomium globosum）：98M－6，其产生抗癌化合物球毛壳甲素（chaetoglobosinA）。结论 美登木内生真菌中，有的内生真菌可产生与宿主所产的美登素（maytensine）不同的抗癌物质。     

珠子参种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的研究珠子参Panax japonicus种质资源的遗传多样性。方法采用ISSR分子标记技术,通过聚类分析和主坐标分析,研究3个主要产地珠子参的19个样本的遗传多样性和亲缘关系。结果 13条ISSR引物扩增出181条带,其中有166条呈现多态性,占91.71%,遗传相似系数变化范围0.60~0.83。聚类分析和主坐标分析结果一致,将源于同一地区的珠子参样本聚在一起,呈现出一定的地域性分布规律。结论珠子参样本之间的遗传多样性水平较高,种质间的亲缘关系和地理位置有一定关系。     

桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌筛选及鉴定

目的:筛选和鉴定濒危藏族药桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌,为保护桃儿七植物资源和发现新的天然活性菌株提供参考。方法:采用组织块法对桃儿七茎部的内生真菌进行分离,利用TLC和HPLC检测其代谢产物中的鬼臼毒素类成分,检测波长254 nm,流动相乙腈-水(40∶60)。采用形态学和分子生物学相结合的方法对产鬼臼毒素类成分的内生真菌进行鉴定。结果:共分离得到9株内生真菌,其中菌株J-1,J-2,J-3的发酵液中含有鬼臼毒素类成分,分别鉴定为Chaetomium globosum strain MF564,C.sp.4RF3和Pseudallescheria sp.T55。结论:从桃儿七茎中分离到3株产鬼臼毒素类成分的内生真菌,分别来源于2个新属的不同种菌株,为开发新绿色生物能源和实现内生真菌工业发酵生产鬼臼毒素类成分奠定了理论基础。     

叶下珠种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的对分布于我国30个居群的叶下珠进行遗传多样性分析。方法采用ISSR分子标记技术,研究来自我国重庆、陕西、河南、云南、广西、广东、浙江、贵州、福建、海南省区共30个叶下珠居群的遗传多样性。结果从60个ISSR引物中筛选出24个用于扩增,共扩增得到264条条带,其中共有条带19条,多样性条带245条,多态位点百分率(PPB)为92.80%,遗传相似性系数(GS)值在0.579 5～0.916 7,多态性较高。UPGMA聚类结果显示我国叶下珠居群大致可以分为3支,即内陆分支、沿海分支及位于云南省区的过渡分支;个别居群呈现明显的居群特异性。结论叶下珠种质资源遗传多样性较高。     

蒲公英遗传多样性的ISSR分析

目的 分析蒲公英的遗传多样性.方法 采用ISSR分子标记对21个居群蒲公英遗传多样性进行分析,用软件Popgen32分析Nei's基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I),采用NTSYS 2.10e软件进行聚类分析和主坐标分析.结果 16条ISSR引物共扩增出166条条带,其中多态性条带152条,平均多态性百分率为90.4％,平均H为0.286 5,平均I为0.437 0;遗传距离和遗传一致度分别为0.156 2～0.590 2和0.554 2～0.855 4;UPMGA法进行聚类分析显示,聚类结果与地理来源有较强的一致性,可以看出来源于同一地区的蒲公英种质聚在一起,呈现出一定的地域性分布规律.结论 采用ISSR分析蒲公英遗传多样性,蒲公英表现出丰富的多态性,表明可以用ISSR标记技术对蒲公英进行分子水平的遗传多样性分析.     

基于ISSR的新疆贝母属植物遗传多样性研究

目的 通过对新疆贝母属植物进行遗传多样性分析,以期获得新疆贝母属不同种之间的遗传多态性.方法 应用琼脂糖凝胶电泳法结合ISSR分子标记,对所选材料进行遗传多样性与亲缘关系的综合分析.结果 2％琼脂糖凝胶电泳扩增总条带数为185条,其中多态性条带为181条,多态性条带比率(PPB)为97.84％.基于UPGMA软件对10种贝母的遗传差异性分析表明,12个ISSR引物可以将新疆贝母不同种之间遗传差异明显区分开来,其遗传相似系数范围在0.37～0.80,以0.50为最低遗传相似系数,可将10种贝母分成4个大类.结论 揭示了10种贝母种质资源间的遗传多样性与亲缘关系,为新疆野生贝母属植物资源的收集和种间分类等提供理论依据.     

产冬凌草甲素菌株筛选鉴定及其抗肿瘤活性研究

目的对冬凌草内生真菌进行筛选鉴定,并研究其体外抗肿瘤活性,以期得到冬凌草甲素高产抗肿瘤活性菌株。方法采用TLC法和HPLC法对前期从冬凌草中分离出的256株内生真菌进行筛选,HPLC-MS测定菌株发酵液中的冬凌草甲素。结合形态学特征、ITS序列对筛选出的菌株进行鉴定。MTT法测定筛选菌株的体外抗肿瘤活性。结果从冬凌草中分离出的256株内生真菌经筛选,获得1株冬凌草甲素高产菌株M-J-5,鉴定为青霉属草酸青霉菌Penicillium oxalicum Currie et Thom,其对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞活性具有一定抑制作用。结论从冬凌草内生真菌中筛选得到产冬凌草甲素且具抗肿瘤活性的菌株M-J-5。     

ISSR分子标记在白芍亲缘关系的应用研究

目的：研究安徽、山东、北京、四川的栽培白芍和山西野生白芍的遗传多样性和亲缘关系,确定不同产区的白芍种质资源的差异,为白芍育种研究提供一定参考。方法：运用ISSR 分子标记技术,研究14份材料的遗传多样性水平。结果：选择条带清晰、多态性高、重复性好的7条引物进行扩增,共获得56条片段,其中多态性条带38条,平均多态性比率为67.86%;运用NTSYS软件计算样品间的遗传相似系数（GS值）,得到样品间遗传相似系数矩阵,其中亳州1号和亳州2号间相似系数最大,这说明两者间亲缘关系较近,遗传差异小;北京2号和山西野生白芍相似系数最小,说明两者间亲缘关系较远,遗传差异大;利用UPGMA法,根据遗传相似系数对各样品进行聚类分析,在GS值为0.72时把14个样品分为两大类群,北京和安徽栽培白芍为一个类群,其他品种为另一个类群。结论：4个产区的栽培白芍和山西野生白芍存在一定的遗传差异性,可以从基因水平把植株外型相似的栽培品种区分开,对新品种的选育有很大的意义。     

宁夏枸杞内生菌的抗菌和抗肿瘤活性研究

为筛选具有抗菌抗肿瘤活性的枸杞内生菌资源,对分离自宁夏枸杞的10株内生菌发酵液的抑菌活性和体外细胞毒活性进行检测,通过ITS和16S rDNA序列分析对菌株进行了分子鉴定。结果表明,5株内生真菌对供试病原菌都未表现出抑制活性,放线菌AL6对3种病原真菌都有一定的抑制作用,而AL5仅对金黄色葡萄球菌有较强抑制活性。但内生真菌的抗肿瘤活性明显强于放线菌。当发酵液浓度为0.2 g·L~(-1)时,有4株内生真菌至少对1种肿瘤细胞的抑制率高于50%。序列分析表明,5株内生真菌隶属于曲霉属、青霉属和翘孢霉属。5株内生放线菌隶属于链霉菌属、微球菌属和拟诺卡氏菌属。曲霉属菌株FL1对A549和HeLa细胞的抑制活性都较强,其IC_(50)分别为0.022,0.028 g·L~(-1),值得进一步研究。