苦参碱诱导人结肠癌SW1116细胞凋亡及机制探讨

目的观察苦参碱（Ma）诱导结肠癌SW1116细胞凋亡的作用，并探讨其机制。方法采用不同浓度的Ma处理SW1116细胞48h，并设正常对照组，MTT法检测细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，半定量RT-PCR检测Fas和Bax mRNA表达水平。结果与正常对照组相比，不同浓度Ma处理的SW1116细胞抑制率、胞凋亡率显著升高（P均〈0.01），Fas和Bax mRNA表达上调（P〈0.05，P〈0.01）。结论Ma可诱导SW1116细胞凋亡，其作用机制可能与上调Fas和Bax mRNA表达有关。     

siRNA沉默PPARα减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡

背景:多药耐药一直是遏制提高结肠癌化疗有效性的瓶颈问题。目的:探讨沉默PPARα能否减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡,从而阐明PPARα在羟喜树碱耐药中的潜在作用。方法:构建针对PPARα基因的siRNA干扰载体,并转染人结肠癌SW1116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞,以RT-PCR和蛋白质印迹法验证干扰效果。经羟喜树碱干预后,以MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。以定量RT-PCR检测不同浓度miR-506前体转染SW1116细胞后对PPARα下游调控靶基因mRNA表达的影响。结果:siRNA干扰载体Ⅲ的沉默效果最佳,PPARα mRNA和蛋白表达分别下调了约94.1%±3.4%和70.8%±8.6%。稳定转染siRNA的SW1116细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为(332±19)μg/L,亲本SW1116细胞为(152±12)μg/L。在相同浓度羟喜树碱的作用下,亲本SW1116细胞的凋亡率显著高于稳定转染siRNA的SW1116细胞(150μg/L:7.0%±2.5%对2.8%±1.6%;300μg/L:32.4%±7.1%对18.5%±2.7%)。miR-506前体下调HMGCS-2表达,上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达,其中上调CCND1的作用最为明显。结论:成功构建了针对PPARα的siRNA干扰载体;沉默PPARα能增强SW1116细胞对羟喜树碱的抵抗性,可能与下调HMGCS-2表达并上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达有关。     

氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116杀伤作用的实验研究

目的探讨氧化苦参碱(OM)对于人结肠癌细胞株SW1116的杀伤作用及其抗肿瘤作用的机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、PCR—ELISA和RT-PCR法检测OM对SW1116细胞的杀伤作用、细胞周期分布、端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)及其上游调控基因(c-myc、p53、mad1)表达的影响。结果0M对SW1116细胞具有剂量依赖性杀伤作用；可以引起G1／G0期细胞增加、S期细胞减少；OM可抑制SW1116细胞的端粒酶活性，其作用呈剂量和时间依赖性；OM可引起SW1116细胞hTERT基因表达下调，pS3和mad1基因的表达升高，对c-myc基因的表达无影响。结论OM对人结肠癌细胞株SW1116具有杀伤作用，可能通过影响hTERT及其上游调控基因的表达来抑制肿瘤细胞端粒酶活性，发挥其抗肿瘤作用。     

Fas相关死亡结构域蛋白增强5-氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞生长作用的研究

目的 通过体外和体内实验研究结肠癌细胞在稳定转染Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)基因后对5-氟尿嘧啶的敏感性,探讨FADD基因与5-氟尿嘧啶联合治疗结肠癌的可行性.方法 ①RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染FADD基因的结肠癌细胞SW480/FADD、稳定转染空载体的结肠癌细胞SW480/neo和正常结肠癌细胞SW480中FADD基因的mRNA和蛋白表达水平.②MTT法检测3种细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性.TUNEL法和流式双染法检测细胞凋亡率.Western印迹法检测caspase-8和caspase-3的表达.③裸鼠成瘤实验观察瘤体生长曲线,病理学和TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 ①SW480/FADD细胞FADD基因mRNA和蛋白表达水平明显较SW480和SW480/neo增高(P＜0.05).②5-氟尿嘧啶对SW480/FADD的抑制率明显高于SW480和SW480/neo,差异有统计学意义(P＜0.05).③5-氟尿嘧啶(10 mg/L)干预48 h后,SW480/FADD凋亡率达(33.3±4.5)%,与SW480[(13.9±3.2)%]和SW480/neo[(14.1±3.4)%]间差异有统计学意义(P＜0.05).④5-氟尿嘧啶(10 mg/L)干预48 h后,SW480、SW480/neo的procaspase-8和procaspase-3表达比SW480/FADD增高,而cleaved easpase-8和cleaved caspase-3的表达比SW480/FADD降低(P＜0.05).⑤SW480/FADD对5-氟尿嘧啶更加敏感,瘤体体积增加幅度明显小于SW480和SW480/neo,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 稳定转染FADD基因可明显增加结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性,二者联合应用在结肠癌治疗中有潜在的价值.     

生存素反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞株凋亡的实验研究

背景:生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族的成员之一,在肿瘤组织和人类胚胎组织中有高水平表达,在分化成熟的组织中不表达或低水平表达。有研究显示,64.5%～85%的结肠癌组织中存在生存素基因表达,其表达与结肠癌患者的不良预后有关。目的:观察生存素反义寡核苷酸对结肠癌细胞株凋亡的影响。方法:通过基因工程技术构建生存素反义寡核苷酸质粒pcDNA3鄄sur鄄As,以脂质体转染的方法将质粒DNA转入结肠癌细胞株。应用逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测结肠癌细胞株中生存素mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪和碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡,比色测定检测caspase鄄3活性的变化。结果:SW1116、COLO205、HT鄄29和SW1417四株结肠癌细胞株中均有生存素mRNA和蛋白表达。瞬时转染生存素反义寡核苷酸后,4株结肠癌细胞株的细胞凋亡率均明显增加,并呈剂量依赖性(P<0.01);结肠癌细胞株SW1116在荧光显微镜下呈现典型的凋亡细胞形态,细胞中生存素蛋白表达水平明显降低,caspase鄄3活性显著增加(P<0.01)。结论:应用生存素反义寡核苷酸抑制生存素基因的表达能诱导结肠癌细胞株凋亡,以生存素为靶基因的治疗方案可能有助于结肠癌患者的治疗。     

miR-506在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的功能研究

目的探讨miR-506在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的潜在作用。方法首先通过PCR从基因组DNA中克隆出包含miR-506前体的片段,将其连接至miRNA表达载体pMIF-cGFP-Zeo中,测序进行验证。将构建成功的pMIF-miR-506转染至低表达miR-506的亲本细胞SW1116中,加入含G418的选择性培养基进行选择性培养。运用RT-PCR验证稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株中的miR-506的表达情况,MTT法检测稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株和亲本细胞SW1116对羟基喜树碱的敏感性差异,Annexin V/PI检测各自对羟基喜树碱的凋亡情况。结果测序结果表明hsa-miR-506的前体序列被成功地构建至miRNA表达载体pMIF-cGFP-Zeo中。TaqMan荧光定量PCR技术检测发现,相比亲本细胞SW1116,稳定表达绿色荧光的SW1116细胞克隆中miR-506的含量显著升高,约为33.7±8.3倍。细胞增殖试验表明稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株的IC50为(280±13)μg/L,而对照组SW1116的IC50为(152±12)μg/L。同时还发现在相同浓度的羟基喜树碱作用下,亲本细胞SW1116较稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株的凋亡细胞比率增高(150μg/L:7.8%±1.7%vs5.4%±1.2%;300μg/L:33.6%±3.9%vs18.2%±4.7%)。结论成功地构建了过表达miR-506的载体pMIF-miR-506;过表达miR-506能够增加SW1116对羟基喜树碱的抵抗性。     

Ufd1基因沉默逆转SW1116／HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究

泛素融合降解1样蛋白（Ufd1）在蛋白质逆向转运中发挥一定作用。前期研究发现羟基喜树碱（HCPT）耐药人结肠癌细胞株SW1116／HCPTUfd1表达增高。目的：探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用。方法：干扰组SW1116／HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因．对照组转染非特异性siRNA。体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况。结果：干扰组SW1116／HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组（P〈0．05）。经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显。结论：以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关。     

siRNA靶向干扰IL-12基因对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的观察siRNA干扰白细胞介素(IL)-12基因表达对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法将含有IL-12 siRNA的表达质粒稳定转染人脑胶质瘤细胞,应用western印迹杂交检测IL-12的表达变化,噻唑蓝(MTT)法及吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色观察脑胶质瘤细胞的增殖与凋亡情况。结果转染后,western印迹检测显示IL-12 siRNA组的IL-12表达较阴性对照组及空载体组显著降低(P<0.01),MTT法显示IL-12siRNA组中的细胞生长受抑明显,AO/EB染色显示IL-12 siRNA组的凋亡率较阴性对照组及空载体组高。结论 IL-12 siRNA靶向干扰了IL-12蛋白的表达,并对脑胶质瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响。方法采用真核细胞转染技术将pSi-lencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒转染人结肠癌HCT116细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR、Western blot及免疫组化法分别观察STAT3基因和蛋白的变化,流式细胞仪及AO/EB染色观察细胞凋亡。结果 pSilencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒对大肠癌细胞的增殖有明显抑制作用,与空白组及阴性组相比差异有统计学意义(P0.05);在重组质粒组,STAT3基因mRNA及蛋白的表达与空白组及阴性组相比明显减低(P0.05);重组质粒可诱导HCT116细胞凋亡,细胞周期分期示细胞阻滞于G2期。结论 pSilencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3基因在人大肠癌细胞中的表达。     

小干扰RNA表达质粒转导逆转人结肠癌羟基喜树碱耐药表型的研究

目的探讨结肠癌羟基喜树碱(HCPT)多药耐药现象的逆转策略。方法应用RT-PCR法检测结肠癌HCPT耐药细胞中耐药相关基因的表达;构建并转导乳腺癌耐药蛋白(BCRP)基因小干扰RNA(siRNA)表达质粒;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法进行药物敏感实验;流式细胞仪测定细胞周期分布;软琼脂克隆形成实验检测肿瘤细胞体外成瘤性;RT-PCR和Western印迹法测定BCRP基因敲除效果。结果SW1116/HCPT细胞8个耐药相关基因中,2个表达下调,4个表达上调,还有2个表达无明显改变;成功构建BCRP基因siRNA表达质粒,转染效率约42%;与耐药细胞相比,转染细胞对HCPT敏感性增加,IC_(50)下降62.5%;转染细胞周期分布有明显改变:G1期细胞减少,S期细胞增加;转染细胞体外成瘤性下降,形成克隆体积减小;RT-PCR和Western印迹显示,转染细胞中BCRP基因mRNA和蛋白质的表达下降甚至消失。结论siRNA表达质粒转导是逆转结肠癌HCPT耐药现象的一种有效手段。     

血管紧张素转化酶Ⅱ对吉西他滨治疗胰腺癌细胞株敏感性的影响

目的探讨血管紧张素转化酶Ⅱ（ACE2）在胰腺癌细胞化学治疗中的作用。方法构建质粒,通过脂质体转染技术将质粒DNA转入胰腺癌细胞株SW1990并建立稳定高表达ACE2的胰腺癌细胞克隆。设实验组（转染ACE2表达质粒）、阴性对照组（转染GFP对照质粒）及未转染组,Western印迹法检测转染后各组细胞ACE2蛋白的表达。采用化学治疗药物吉西他滨作用不同处理组细胞,应用MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞仪和TUNEL法检测细胞的凋亡变化。结果50μmol／L吉西他滨干预细胞24h后,实验组、阴性对照组和未转染组的细胞增殖抑制率分别为（51．2±4．8）％、（24．2±3．3）％和（21．3±2．6）％,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;流式细胞计数检测实验组细胞凋亡较阴性对照组及未转染组明显增加[（31．2±3．8）％、（17．64±2．3）％、（15．9±1．7）％,P〈0．05],TUNEL标记分析发现典型凋亡特征。结论稳定高表达ACE2基因可明显增强SW1990对吉西他滨的治疗敏感性,两者联合应用在胰腺癌治疗中具有潜在的价值。     

野生型p53基因对肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的研究人野生型p53基因对肠癌细胞系SW480增殖及凋亡的影响。方法阳离子脂质体介导转染人野生型p53基因至SW480细胞系,利用MTT检测该基因对SW480细胞增殖的影响;利用Western blot检测CyclinD1及Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果与对照组比较,转染人野生型p53基因后的SW480细胞的增殖能力受到抑制;Cy-clinD1蛋白水平下调,Bcl-2、Bax表达呈负相关趋势。结论野生型p53基因在一定程度上可诱导肿瘤细胞凋亡。     

三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用

目的研究三氧化二砷(As2O2)对人、鼠肝癌细胞株凋亡的诱导作用.方法用不同质量浓度(0.25,0.5,1,2,3,4 mg/L)的三氧化二砷处理体外培养的鼠7919,人HePG2肝癌细胞株,以MTT比色法、AO/EB荧光染色法、DNA凝胶电泳和免疫组化染色法检测细胞凋亡.结果不同浓度的三氧化二砷均可抑制7919,HePG2细胞生长;AO/EB荧光染色在荧光显微镜下观察肝癌细胞呈典型的凋亡形态学改变;DNA凝胶电泳呈梯形条带为凋亡的特征;免疫组化染色加药组bcl-2表达下调,bax表达上调,对照组bcl-2表达上调,bax表达下调,两株细胞结果相同.结论As2O3对两株细胞均有诱导凋亡作用.这为临床应用As2O3治疗肝癌提供了一个可供参考的实验依据.     

酒石酸锑钾诱导人结肠癌细胞凋亡

目的研究表明酒石酸锑钾能抑制白血病细胞及淋巴瘤细胞生长，并诱导其凋亡。本研究旨在探讨酒石酸锑钾诱导人结肠癌SW480凋亡的作用。方法将不同浓度酒石酸锑钾作用于体外培养人结肠癌SW480细胞。采用MTT法检测酒石酸锑钾对结肠癌SW480细胞的生长抑制作用。并计算生长抑制率；流式细胞术检测亚二倍体峰，并利用TUNEL法进行凋亡的分子生物学检测。结果酒石酸锑钾能明显抑制结肠癌细胞生长，抑制作用呈时间和剂量依赖性；流式细胞仪检测到亚二倍体峰，亚二倍体细胞比例随时间延长而增加。TUNEL法观察到棕褐色着染的凋亡阳性细胞。结论酒石酸锑钾能抑制SW480细胞生长并诱导细胞凋亡。     

柚皮苷通过调控ARHI基因表达对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

目的研究柚皮苷是否通过调控ARHI基因表达影响结肠癌细胞的增殖和凋亡。方法采用不同浓度的柚皮苷处理结肠癌细胞SW620,MTT法检测细胞增殖,免疫印迹实验(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、ARHI蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR(qRT-PCR)检测ARHI mRNA表达。在SW620细胞中转染pcDNA-ARHI,或转染si-ARHI,并使用柚皮苷处理,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果与对照组比较,柚皮苷明显增加SW620细胞的增殖抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表达量、ARHI mRNA和ARHI蛋白表达量,显著降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平,均呈浓度依赖性(P0.05)。ARHI过表达明显增加SW620细胞的抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表达量,显著降低CyclinD1和Bcl-2蛋白水平(P0.05)。抑制ARHI表达逆转了柚皮苷对SW620细胞增殖抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表达的促进作用,及对CyclinD1和Bcl-2蛋白表达的抑制作用。结论柚皮苷通过上调ARHI基因的表达,抑制结肠癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

VEGFR-3 siRNA腺病毒表达载体对结肠癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的探讨靶向血管内皮细胞生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)腺病毒载体对人结肠癌Lo Vo细胞系凋亡及侵袭的影响。方法将靶向VEGFR-3 siRNA腺病毒转染结肠癌Lo Vo细胞,以Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达,Hoechst 33342染色法和流式细胞仪检测Lo Vo细胞的凋亡情况,用Transwell小室测定Lo Vo细胞的侵袭力。结果实验组与空白对照组和阴性对照组比较,实验组中转染靶向VEGFR-3 siRNA腺病毒后结肠癌Lo Vo细胞中VEGFR-3蛋白的表达被下调(P0.05)。Hoechst 33342染色法和流式细胞仪检测Lo Vo细胞凋亡率明显升高(P0.05),Transwell小室测定Lo Vo细胞侵袭能力下降(P0.05)。结论靶向VEGFR-3 siRNA腺病毒能下调结肠癌LoVo细胞中VEGFR-3蛋白的表达,从而诱导结肠癌Lo Vo细胞的凋亡,抑制其侵袭能力,因此,VEGFR-3可以作为结肠癌靶向治疗的一个潜在靶点。     

钯配合物对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用及机制

目的 探讨钯配合物(PBIPS)对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的抑制作用及其机制.方法 MTT法检测PBIPS对MCF-7的细胞毒性,荧光显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术(FCM)检测MCF-7细胞的凋亡率;Western-blotting检测不同浓度PBIPS作用48 h凋亡蛋白survivin 、caspase-3及bcl-2和bax的表达情况.结果 PBIPS可以时间和剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的生长;与对照组比较,PBIPS不同浓度剂量组AO/EB荧光染色出现典型的凋亡形态学改变;FCM检测表明MCF-7细胞凋亡率各实验组均明显高于对照组(P＜0.01),且呈时间剂量依赖性;Western blotting显示与对照组相比,各实验组PBIPS可显著下调MCF-7细胞survivin和bcl-2的表达(P＜0.01),而caspase-3和bax的表达显著增加(P＜0.01).结论 PBIPS能明显诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,其机制可能与改变凋亡相关基因survivin、bcl-2、caspase-3及bax的表达有关.     

程序性细胞死亡5因子增强顺铂抑制结肠癌细胞生长作用的体外研究

目的通过体外实验研究稳定转染程序性细胞死亡5(PDCD5)因子的结肠癌细胞对顺铂的敏感性,探讨PDCD5因子与顺铂联合治疗结肠癌的可行性。方法实时定量RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染PDCD5因子的结肠癌细胞SW480/PD-CD5、稳定转染空载体的结肠癌细胞SW480/Neo以及正常结肠癌细胞SW480的PDCD5因子的mRNA和蛋白表达水平。MTT法检测3种细胞对顺铂的敏感性。Hoechst 33258法和流式双染法检测3种细胞在顺铂干预下的凋亡率。Western印迹法检测3种细胞在顺铂干预下Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Cyt c的表达水平。结果 SW480/PDCD5中PDCD5因子mRNA和蛋白表达水平较SW480和SW480/Neo增高(P<0.05)。SW480/PDCD5增殖抑制率高于SW480和SW480/Neo,生存率低于SW480和SW480/Neo(P<0.05)。顺铂(10 mg/L)干预24 h后,SW480/PDCD5凋亡率高于SW480和SW480/Neo(P<0.05)。顺铂(10 mg/L)干预24 h后,SW480、SW480/Neo的Bcl-2、Bcl-xL以及核内Cyt c表达较SW480/PDCD5增高(P<0.05),而Bax和胞浆Cyt c的表达较SW480/PDCD5降低(P<0.05)。结论稳定转染PDCD5因子可以增加结肠癌细胞对顺铂的敏感性,二者联合应用在结肠癌治疗中有潜在价值。     

PDCD5因子增强顺铂抑制结肠癌细胞生长作用的体内研究

目的通过体内实验研究稳定转染程序性细胞死亡5(PDCD5)因子的结肠癌细胞对顺铂的敏感性,探讨PDCD5因子与顺铂联合治疗结肠癌的可行性。方法稳定转染PDCD5因子的结肠癌细胞SW480/PDCD5、稳定转染空载体的结肠癌细胞SW480/Neo及正常结肠癌细胞SW480分别接种到裸鼠皮下,形成皮下移植瘤后,顺铂(10 mg/kg)腹腔内注射,绘制移植瘤生长曲线;组织学观察皮下移植瘤,TUNEL法检测皮下移植瘤的凋亡情况;Western印迹法检测皮下移植瘤caspase-9和caspase-3的表达水平。结果 SW480/PDCD5对顺铂更加敏感,肿瘤体积增加幅度低于SW480和SW480/Neo(P0.05);SW480/PDCD5有更多的细胞出现变性坏死,更多的细胞染色体边集并出现凋亡小体,出现凋亡细胞的比例高于SW480和SW480/Neo(P0.05);SW480/PDCD5中caspase-9和caspase-3的活化片段较SW480和SW480/Neo更多(P0.05)。结论稳定转染PDCD5因子可以增加结肠癌细胞对顺铂的敏感性,二者联合应用在结肠癌治疗中有潜在的价值。     

丝裂原活化蛋白激酶特异性小干扰RNA表达载体对结肠癌细胞周期和DNA甲基化的影响

目的 构建丝裂原活化蛋白激酶（MEK）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体，观察其静默效应及对结肠癌细胞SW1116生长周期和DNA甲基化的影响。方法 选择MEK不同靶点寡核苷酸片段，克隆到pGCsilencer真核表达载体中。脂质体转染SW1116细胞，荧光显微镜评估转染效率，G418筛选稳定表达siRNA的细胞。Western印迹法检测siRNA对MEK蛋白表达的静默效果。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞生长活力，流式细胞术分析细胞周期，甲基化特异性PCR和DNA测序检测p16^INK4A基因启动子甲基化状态。结果 构建2个靶点的MEK重组质粒，分别转染和联合转染SW1116细胞，转染效率约为72．1％，G418筛选培养2周得到稳定表达MEK siRNA的细胞，MEK蛋白抑制率分别为74．2％和69．1％和90．2％，下游分子ERK蛋白磷酸化水平随之降低；细胞增殖活力下降2～4倍和细胞周期阻滞于G1期，细胞周期负调控冈子p16^INK4A启动子区呈低甲基化状态。结论 MEK特异性siRNA表达载体对结肠癌细胞MEK蛋白表达有一定的静默效果，多靶点联合效果更好，阻滞细胞周期于G1期，促进p16^INK4A基因去甲基化。