Tiam1基因沉默对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的研究沉默T淋巴瘤侵袭转移诱导因子(Tiam)1基因对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,并探讨其可能的分子机制。方法通过RNA干扰(RNAi)技术沉默胰腺癌BxPC-3细胞中Tiam1的表达,Western印迹实验检测其沉默效果;将转染处理过的胰腺癌细胞接种于裸鼠皮下,建立胰腺癌皮下移植瘤模型;观察肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,裸鼠处死后,取瘤称重;苏木素-伊红(HE)染色法观察移植瘤组织病理学结构;免疫组织化学染色法(IHC)检测移植瘤组织增殖相关蛋白Ki-67,转移相关蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Slug的表达。结果 RNAi技术可有效沉默胰腺癌BxPC细胞中Tiam1的表达,并成功构建胰腺癌裸鼠移植瘤模型;与对照组比较,si-Tiam1组裸鼠肿瘤体积与质量均明显降低(P<0.05);HE染色结果显示,与对照组比较,si-Tiam1组中肿瘤组织出现细胞皱缩、片状坏死等病理性改变;IHC结果显示,与对照组相比,si-Tiam1组移植瘤组织中Ki-67、Vimentin、Slug的表达明显降低,而E-cadherin的表达明显升高。结论沉默Tiam1能有效抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与Ki-67、Vimentin、Slug表达的降低及E-cadherin的表达增强有关,提示Tiam1有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶标。     

RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制

目的:探讨RNA干扰DNMT1基因对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及相关机制.方法:利用Lipofectamine TM2000转染DNMT1-siRNA至胰腺癌细胞BxPC-3.实验共分为3组:实验组(转染DNMT1-siRNA)、阴性对照组(转染negative-siRNA)和空白对照组(转染脂质体).转染48h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞体外增殖活力;FCM法检测细胞凋亡;甲基化特异性PCR法(MSP)检测抑癌基因p16、RASSF1A和ppENK的启动子甲基化状态.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.01);实验组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡率明显增加(44.46%±5.98%vs3.74%±1.02%vs5.07%±1.16%,P<0.01).空白对照组与阴性对照组的p16、RASSF1A和ppENK基因甲基化阳性,而实验组的p16和ppENK基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化.结论:DNMT1基因表达下调后,能抑制胰腺...     

Slug-siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌的抑制作用

目的: 研究携带Slug-siRNA的rAAV对裸鼠体内胰腺癌的作用.方法: 建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,2wk后随机将建模成功的裸鼠分为3组,每组6只. 构建携带Slug-siRNA的rAAV载体,采用瘤体内多点注射的方法,阴性对照组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV-EGFP,空白对照组裸鼠注射等量生理盐水,实验组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV2-EGFP-slugsiRNA,只注射1次. 观察裸鼠的一般情况,摄食,活动能力,每周用电子天平秤体质量,绘制裸鼠生长曲线. 治疗6 wk后二氧化碳吸入法处死裸鼠,切取肿瘤称质量;免疫组织化学SP法检测slug蛋白的表达,TUNEL检测皮下移植瘤细胞凋亡,透射电镜检测细胞超微结构.结果: 3组裸鼠分别接受不同的处理后,在开始的2 wk皮下移植瘤的生长无明显差别,2 wk以后,实验组裸鼠皮下移植瘤的体积增长明显滞后于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05). 治疗6 wk后,实验组裸鼠皮下移植瘤的质量明显轻于阴性对照组和空白对照组差异有统计学意义(3.26±0.48 g vs7.56±1.25 g,7.50±1.23 g,均P<0.05). 实验组裸鼠皮下移植瘤的AI值明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(0.27±0.06vs 0.024±0.01,0.025±0.01,均P<0.05);实验组的抑瘤率明显高于阴性对照组,差异有统计学差异(71.4% vs 0.04%,P<0.01). 透射电镜下,实验组肿瘤细胞可见细胞器结构模糊,核固缩,染色质边集等现象. 免疫组织化学检测示实验组Slug表达明显减少.结论: Slug基因被有效沉默,Slug基因沉默后促进细胞凋亡,抑制胰腺癌实体瘤增殖和生长.     

SLP-2 siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨SLP-2siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法:设计合成化学修饰的SLP-2siRNA,将胃癌细胞SGC-7901接种于裸鼠皮下建立裸鼠胃癌移植瘤模型,随机分为转染SLP-2siRNA组、阴性对照组和空白对照组,于肿瘤局部分别多点多次注射化学修饰SLP-2siRNA、阴性对照siRNA及生理盐水.检测3组移植瘤细胞增殖及凋亡状况,RT-PCR及免疫组织化学技术检测移植瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达.结果:与两对照组相比,注射化学修饰的SLP-2siRNA后,裸鼠胃癌移植瘤细胞生长速度减慢、移植瘤体积减小(P=0.009,P=0.003).抑制瘤率分别为26.74%和30.15%,细胞凋亡无明显变化(P>0.05),肿瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达量降低.结论:SLP-2siRNA可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长,但对细胞凋亡无影响,提示SLP-2基因参与促进胃癌细胞增殖.     

静默人类真核延伸因子1A2对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨静默人类真核延伸因子1A2(EEF1A2)对胰腺癌细胞体内生长的影响及其可能的机制.方法 建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,均分为空白组、阴性对照组、EEF1A2组,移植瘤内分别注射PBS、阴性对照siRNA和特异性EEF1A2 siRNA.测定各组移植瘤的体积和质量;应用免疫组织化学的方法检测各组移植瘤组织中EEF1A2和抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)的表达;应用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率.结果 在裸鼠移植瘤模型中,从给药后第17天开始,EEF1A2组移植瘤体积增长明显滞后于阴性对照组和空白组(P值均＜0.05).治疗结束后切取肿瘤称重,EEF1A2组肿瘤质量为(0.27±0.06)g,显著低于阴性对照组和空白组[(0.39±0.08)g和(0.43±0.07)g,P＜0.05].EEF1A2主要表达于胰腺癌细胞胞质,其中在阴性对照组和空白组中,阳性细胞分布比较密集,阳性率分别为(72.58±25.47)％和(76.75±23.19)％,而EEF1A2组阳性细胞分布较稀疏,阳性率为(34.78±21.36)％,差异有统计学意义(P＜0.01).EEF1A2组的PCNA蛋白表达也显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.01),而原位末端转移酶标记技术(TUNEL)的结果显示EEF1A2组中细胞凋亡率高于空白组和阴性对照组(P＜0.01).结论 EEF1A2在体内能被有效静默,EEF1A2静默后能明显抑制胰腺癌细胞的生长,可能与其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关.     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.     

PGL3-DF3-DTA对DF3阳性人乳腺癌细胞的体内杀伤作用及机制探讨

将36只4周龄雌性SPF级裸鼠随机分为实验组、空载体组、空白对照组、阴性对照组四组，每组各9只。将人乳腺癌MCF-7细胞接种于前三组裸鼠皮下，MDA-MB-231细胞接种于阴性对照组裸鼠皮下。待成瘤后，将重组表达载体PGL3-DF3-DTA和PGL3-DF3多次、多位点注射入相应裸鼠移植瘤内。观察肿瘤体积变化情况。并于接种后2、5、7周分批处死动物，用免疫组化技术检测瘤组织中LYVE-1、F8、Ki-67、bax、Bcl-2蛋白的表达。结果从接种后3周起，实验组裸鼠肿瘤体积明显小于其他三组；从接种后5周起实验组裸鼠瘤细胞LYVE-1、F8、Ki-67、Bcl-2表达水平降低，bax表达水平升高。认为重组表达载体PGL3-DF3-DTA能对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用。其机制可能与PGL3-DF3-DTA下调LYVE-1、F8、Ki-67、Bcl-2表达及上调bax表达有关。     

慢病毒载体介导CD55抑制对胰腺癌BxPC-3细胞迁移、侵袭和成瘤的影响

目的探讨慢病毒载体介导的RNA沉默CD55基因抑制胰腺癌BxPC-3细胞迁移、侵袭和成瘤的效果及机制。方法采用CD55-RNAi-LV(慢病毒包装靶向抑制CD55的shRNA载体)转染BxPC-3细胞(实验组),设转染NC-GFP-LV(慢病毒包装作对照的空载体)的BxPC-3细胞为对照组,未转染的BxPC-3细胞为空白组。Transwell法检测各组细胞体外迁移、侵袭能力。三组细胞分别以1.0×107/200μL的浓度注入裸鼠皮下,7周观察成瘤情况。结果与对照组及空白组比较,实验组细胞迁移能力及侵袭能力明显减弱(P均<0.05);瘤体出现晚且瘤体体积小(P<0.05)。结论 CD55基因对胰腺癌细胞系BxPC-3细胞迁移、侵袭和成瘤能力有调控作用,可望成为胰腺癌新的治疗靶点。     

腺病毒介导CD/UPRT自杀基因系统治疗胰腺癌的实验研究

目的探讨CD/UPRT自杀基因系统在胰腺癌基因治疗中的作用。方法采用同源重组技术构建重组腺病毒Ad-CD、Ad-CD/UPRT和Ad-GFP;体外感染人胰腺癌SW1990细胞,RT-PCR检测UPRTmRNA表达;MTT法检测细胞对5-FC的敏感性及旁观者效应;流式细胞仪分析细胞凋亡率;建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体内直接注射腺病毒,观察CD/UPRT自杀基因的原位治疗作用。结果转染CD/UPRT的胰腺癌SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高,Ad-CD/UPRT组的IC50为25μmol/L,而Ad-CD组和Ad-GFP组分别为100μmol/L和>1000μmol/L。Ad-CD组、Ad-CD/UPRT组和Ad-GFP组的细胞凋亡率分别为61.3%、40.5%和3.0%,3组比较有显著差异(P<0.05)。CD/UPRT基因转染存在旁观者效应。Ad-CD/UPRT瘤内注射治疗后种植癌体积缩小81%,Ad-GFP治疗肿瘤缩小63%。结论CD/UPRT自杀基因系统能提高对胰腺癌细胞的杀伤作用。     

腺病毒介导CD/UPRT自杀基因系统治疗胰腺癌的实验研究

目的 探讨CD/UPRT自杀基因系统在胰腺癌基因治疗中的作用.方法 采用同源重组技术构建重组腺病毒Ad-CD、Ad-CD/UPRT和Ad-GFP;体外感染人胰腺癌SW1990细胞,RT-PCR检测UPRT mRNA表达;MTT法检测细胞对5-FC的敏感性及旁观者效应;流式细胞仪分析细胞凋亡率;建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体内直接注射腺病毒,观察CD/UPRT自杀基因的原位治疗作用.结果 转染CD/UPRT的胰腺癌SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高,Ad-CD/UPRT组的IC50为25 μmol/L,而Ad-CD组和Ad-GFP组分别为100 μmol/L和＞1 000 μmol/L.Ad-CD组、Ad-CD/UPRT组和Ad-GFP组的细胞凋亡率分别为61.3%、40.5%和3.0%,3组比较有显著差异(P＜0.05).CD/UPRT基因转染存在旁观者效应.Ad-CD/UPRT瘤内注射治疗后种植癌体积缩小81%,Ad-GFP治疗肿瘤缩小63%.结论 CD/UPRT自杀基因系统能提高对胰腺癌细胞的杀伤作用.