刚地弓形虫毒力调节因子研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)主要分3种基因型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型),3型虫株对宿主的毒力具有明显差异。弓形虫棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)中的ROP18、ROP16和ROP5在弓形虫感染过程中会被分泌到宿主细胞内,发挥调节弓形虫毒力的作用,造成不同型虫株间毒力差异,是主要的毒力调节因子。本文对国内外有关弓形虫毒力调节因子的研究进行综述。     

刚地弓形虫棒状体蛋白2家族作为疫苗候选分子的研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白2家族(ROP2 family)是由弓形虫棒状体分泌的一类蛋白质,对弓形虫侵入宿主细胞及发挥细胞毒力起重要作用。ROP2家族成员包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP13、ROP16、ROP17和ROP18。近年来的研究发现,ROP2家族成员作为疫苗候选分子,可诱导宿主产生保护性免疫。本文综述了ROP2家族主要成员作为DNA疫苗或蛋白疫苗的研究进展。     

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

棒状体蛋白16（ROP16）是弓形虫棒状体蛋白家族成员, 其蛋白结构存在丝氨酸、 苏氨酸激酶区, 是弓形虫入侵 过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核, 能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6, 干扰宿主细胞信号 通路传导, 在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、 功能、 免疫保护性等方面进行 综述。     

巴贝虫棒状体蛋白的研究进展

巴贝虫是一类专性的细胞内寄生的顶复门原虫,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体相关蛋白被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子,其在虫体入侵的纳虫空泡形成过程中发挥重要作用。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。因此,本文就目前研究较多的牛巴贝虫、羊巴贝虫、吉氏巴贝虫、双芽巴贝虫和东方巴贝虫等棒状体相关蛋白的研究现状进行了综述。     

刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

目的观察刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒状体蛋白16(ROP16)在入侵宿主细胞过程中的分泌及分布。方法以刚地弓形虫RH株速殖子c DNA为模板,PCR扩增Tgrop16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组蛋白Tg ROP16经纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗Tg ROP16多克隆抗体,用蛋白质印迹(Western blotting)和间接ELISA检测抗Tg ROP16多克隆抗体的特异性和敏感性。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测刚地弓形虫RH株和Pru株速殖子Tgrop16基因的转录水平,Western blotting分析RH株和Pru株Tg ROP16蛋白的表达量。用间接免疫荧光(IFA)检测弓形虫RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纤维细胞(HFFs细胞)过程中,Tg ROP16蛋白在宿主细胞中的分泌与分布。结果制备的抗Tg ROP16多克隆抗体,Western blotting分析结果显示,能与重组蛋白Tg ROP16结合,在相对分子质量(Mr)约100 000处有一特异性条带;间接ELISA检测结果显示,抗体效价为1∶25 600。实时荧光定量PCR检测结果显示,Pru株Tgrop16基因表达量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P0.05)。Western blotting分析结果显示,RH株中Tg ROP16蛋白表达量(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.373)较高于Pru株(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.232)。IFA检测结果显示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白定位于速殖子的顶端复合体,速殖子入侵HFFs细胞后,Tg ROP16蛋白显示在虫体外。结论制备的抗Tg ROP16多克隆抗体特异性和敏感性高;刚地弓形虫RH株速殖子的Tg ROP16蛋白表达量高于Pru株的;两株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白分布于速殖子顶端复合体,在入侵宿主细胞过程中被分泌出虫体。     

刚地弓形虫感染对宿主细胞信号转导的影响

刚地弓形虫在入侵和寄生于宿主细胞,引起急性与慢性感染的过程中,对宿主细胞进行精细的、整体的调控,在激发和抑制宿主免疫反应之间保持一个精细的平衡,保证弓形虫在宿主细胞内成功地生存增殖,并有机会传播给终末宿主;在此过程中宿主细胞的信号转导发生广泛的应激变化,在弓形虫入侵、寄生过程中及与弓形虫-宿主相互关系中起着重要作用。本文拟从5个方面综述弓形虫感染对宿主细胞信号通路的调控作用:①弓形虫分泌蛋白调控宿主细胞信号转导,②弓形虫调节宿主天然免疫、保护性免疫相关的细胞信号通路,③弓形虫调控与抗凋亡及细胞周期相关的宿主细胞信号转导,④弓形虫调节宿主细胞钙离子信号通路,⑤弓形虫调节与细胞结构重组相关的宿主细胞信号转导。     

刚地弓形虫纳虫泡的形成机制及其作用

刚地弓形虫是寄生宿主广泛的细胞内寄生性原虫,人群感染相当普遍。弓形虫侵入宿主细胞后寄居于一个抗宿主细胞内涵体酸化作用和溶酶体融合作用的纳虫泡(parasitophorous vacuole)内,纳虫泡在弓形虫的寄生过程中起着非常重要的作用。本文就弓形虫纳虫泡形成的机制及其在弓形虫寄生宿主细胞过程中的作用进行综述。     

刚地弓形虫抗肿瘤作用及其机制研究进展

刚地弓形虫是一种重要的机会致病性原虫,严重威胁着人类健康,但弓形虫虫体、培养上清/排泄分泌抗原、裂解抗原、分泌蛋白均被证实具有显著的抗肿瘤作用。其中,诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤组织新生血管生成以及增强宿主自身免疫细胞功能的机制在弓形虫抗肿瘤过程中发挥着关键作用。本文综述了弓形虫抗肿瘤作用的研究进展,以及虫体及其相关组分抗肿瘤作用的相关机制。     

一种空间定位rhomboid蛋白酶酶切对弓形虫侵入细胞起重要作用的细胞表面黏附素

已知顶复门的刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能引起严重的人兽共患病，在其复杂的生活史中，缓殖子是引起慢性感染的主要阶段，而速殖子是引起急性感染的主要致病阶段。顶复门原虫含有一整套位于顶端的细胞器，其顺序分泌对虫体侵入细胞是必需的。弓形虫对宿主细胞的极化附着由被称为微线体的细胞器分泌黏附素所介导，微线体分泌蛋白含有跨膜结构域（TMD），     

顶复门原虫棒状体颈部蛋白研究的新进展

顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫。这类原虫具有相似的亚细胞结构和保守的入侵机制,入侵过程是由大量的入侵相关蛋白分子所介导的,包括微线体、棒状体及致密颗粒所分泌的相关蛋白等。棒状体分泌的颈部蛋白对虫体入侵宿主细胞起着关键作用,是这类寄生原虫的毒力因子。本文综述了顶复门原虫棒状体颈部蛋白的最新研究进展。     

弓形虫与疟原虫入侵引起宿主细胞骨架重组相关GTP酶不同定位的观察

弓形虫与疟原虫均是顶复门(Phylum Apicomplexa),孢子纲(Class Sporozoea), 真球虫目(Order Eucoccidiida)的细胞内寄生原虫,入侵宿主细胞后均寄生于纳虫泡内进行发育增殖。细胞内寄生原虫的入侵均需要宿主细胞的细胞骨架发生重组,RhoGTP酶是哺乳动物细胞（有核细胞及红细胞）调节细胞骨架重组的重要酶类。我们在研究中发现宿主细胞的RhoA及Rac1GTP酶在弓形虫速殖子侵染后被纳入了纳虫泡膜（Parasitophorous Vacuole Membrane,PVM）上并高丰度聚集,然而在疟原虫裂殖子侵染的红细胞内却没有发现这两种GTP酶在纳虫泡膜上聚集的现象。宿主细胞RhoA及Rac1GTP酶在弓形虫及疟原虫感染宿主细胞后的不同分布,显示这两种原虫感染引起宿主细胞骨架重组的途径是不同的。     

弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究现状

弓形虫病目前尚无理想的特效治疗药物和防治措施,研制安全便捷、保护力强的核酸疫苗是弓形虫病防治的有效策略。棒状体蛋白（Rhoptry protein, ROPs）是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的一类蛋白,其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫空泡（Parsitophorous vacuole, PV）形成及胞内弓形虫的增殖调控等方面发挥着重要作用,是最具潜力的疫苗候选抗原分子之一。本文就ROPs家族重要成员特性、表达载体选择及其核酸疫苗在动物实验中的免疫原性,以及免疫保护作用等方面进行了概述。     

dsRNA抑制SAG3表达对弓形虫入侵蛋白ROP2、MIC2的影响

目的观察表面抗原3（SAG3）对弓形虫入侵相关蛋白的影响,为深入研究弓形虫的致病机制奠定基础。方法用电穿孔的方法将针对SAG3基因3-′UTR区的dsRNA转入弓形虫速殖子体内,转染后的虫体感染Hela细胞,转染后2 h提取总RNA,RT-PCR检测SAG3的抑制效率,同时检测弓形虫入侵蛋白ROP2、MIC2的表达情况。结果dsRNA电穿孔转染弓形虫速殖子后抑制SAG3 mRNA表达,ROP2、MIC2的表达量显著低于对照组。结论抑制SAG3的表达影响ROP2、MIC2的表达。     

The role of phospholipase in host cell penetration by Toxoplasma gondii

Phospholipase A2 (PLA2) plays an important pathogenic role in infections caused by several microorganisms and has been implicated in host cell invasion. The mechanism of host cell penetration by the intracellular protozoan Toxoplasma gondii involves several steps; we have investigated the role of PLA2 in cellular invasion by the tachyzoite stage of this parasite. We assayed T. gondii invasion of human fibroblast monolayers by measurement of the selective incorporation of 3H-uracil into growing intracellular parasites. Exogenous PLA2 from snake venom (Naja naja) increased the penetration of fibroblasts by T. gondii, while horse antiserum to Naja hannah venom inhibited penetration. An irreversible PLA2 inhibitor, p-bromophenacyl bromide, blocked penetration without metabolically disabling the parasite. When host fibroblasts were preincubated with this drug, penetration was not affected, supporting a role for parasite rather than host cell PLA2 in the penetration process. Another PLA2 inhibitor, nordihydroguaiaretic acid, also inhibited penetration. We assayed extracellular T. gondii tachyzoites, purified from host cell debris, for PLA2 activity by radiometric detection of fatty acid release from labeled Escherichia coli membranes. Sonically disrupted parasites contained a low level of calcium-dependent PLA2 with maximum activity at pH 8.5-9.0. These experiments suggest that a phospholipase is implicated in T. gondii host cell invasion.     

刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族的研究进展

肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)/丝切蛋白(cofilin)家族是一类肌动蛋白结合蛋白(actin-binding proteins,ABP),其家族成员均可与肌动蛋白结合,具有促进微丝解聚的作用,从而提高肌动蛋白单体水平,在重塑肌动蛋白骨架中起重要作用。ADF在顶端复合门寄生虫侵入宿主细胞过程中扮演重要角色。本文综述了刚地弓形虫ADF/cofilin家族的结构特点、调控肌动蛋白动力学机制、参与弓形虫侵入宿主及其在抗弓形虫感染等方面的作用。     

弓形虫关键粘附蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的通过cDNA文库筛选出弓形虫关键粘附蛋白基因一棒状体ROP2基因,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,以获得重组蛋白。方法根据弓形虫棒状体ROP2基因开放阅读框设计引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR,纯化扩增产物经双酶切,进行TA克隆,再克隆到pET-30a中。重组质粒pET-30a—top2经PCR鉴定后,转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,用SDS—PAGE电泳鉴定表达产物。结果获得的1223bp的基因片段经PCR和酶切鉴定后与预期大小一致;SDS—PAGE电泳分析显示诱导菌在52ku处出现一条明显的蛋白带,与预期分子量相符。结论成功构建PET30a—ROP2,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,为进一步研究弓形虫粘附关键蛋白基因与肠上皮细胞的关系奠定基础。     

A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is the most common protozoan parasite of humans. Infection with T. gondii can lead to life-threatening disease as a result of repeated cycles of host cell invasion, parasite replication, and host cell lysis. Relatively little is known about the invasive mechanisms of T. gondii and related parasites within the Phylum Apicomplexa (including Plasmodium spp., the causative agents of malaria), due to difficulties associated with studying genes essential to invasion in haploid obligate intracellular organisms. To circumvent this problem, we have developed a high-throughput microscope-based assay, which we have used to screen a collection of 12,160 structurally diverse small molecules for inhibitors of T. gondii invasion. A total of 24 noncytotoxic invasion inhibitors were identified. Secondary assays demonstrated that different inhibitors perturb different aspects of invasion, including gliding motility, secretion of host cell adhesins from apical organelles (the micronemes), and extension of a unique tubulin-based structure at the anterior of the parasite (the conoid). Unexpectedly, the screen also identified six small molecules that dramatically enhance invasion, gliding motility, and microneme secretion. The small molecules identified here reveal a previously unrecognized complexity in the control of parasite motility and microneme secretion, and they constitute a set of useful probes for dissecting the invasive mechanisms of T. gondii and related parasites. Small-molecule-based approaches provide a powerful means to address experimentally challenging problems in host-pathogen interaction, while simultaneously identifying new potential targets for drug development.