上海地区2009年上半年手足口病患儿肠道病毒71病毒壳体蛋白VP1基因的检测与亚型分析

目的 了解2009年4月至5月肠道病毒(EV)71在上海地区儿童手足口病(HFMD)中的分子流行病学特点.方法 收集2009年4月至5月在复旦大学附属儿科医院临床诊断为HFMD的95例住院患儿咽拭子标本73份与粪便标本38份,采用TaqMan实时RT-PCR及套式RT-PCR进行EV71病毒壳体蛋白VP1基因检测,并进行基因测序分析.结果 73份咽拭子标本中,EV71阳性6份,检出率为8.2%;38份粪便标本中,EV71阳性24份,检出率为63.2%.28份套式RT-PCR阳性标本基因测序分析结果显示,27株为C4亚型,为绝对优势流行株,另有一株为C2亚型株;1例死亡患儿分离株为C4亚型,其VP1基因序列未见明显变异.结论 EV71是上海地区2009年4月至5月儿童HFMD的重要病原体,C4亚型株占绝对优势地位,同时伴有C2亚型株的流行.     

黄梅县手足口病临床分离株的基因型分析

目的:了解手足口病暴发高峰时段临床患者的咽拭子标本中分离出的人肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)的基因型,为手足口病的防治提供依据。方法:将手足口病高峰时期收集的咽拭子标本109份进行病毒分离鉴定,对分离到的4株EV71型病毒株的227bp VP3-VP1基因序列和3株CA16株的736bp VP1-2A基因序列进行基因测序,并进行系统进化分析。结果:检测到的4株EV71分离毒株均属C4a亚群,3株CA16分离毒株均属于B1b亚群。结论:2013年黄梅县手足口病暴发高峰时段的EV71流行株为C4a亚群,CA16流行株为B1b亚群。     

2011年天津市手足口病病原检测与基因特征分析

目的对天津市2011年手足口病(HFMD)进行病原学检测,并对引起HFMD的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行基因特征分析,为天津市HFMD的防控提供基础资料。方法采用Real time RT-PCR方法对HFMD疑似病例标本进行检测,用人横纹肌瘤(RD)细胞对部分阳性标本进行病毒分离;随机挑取16株EV71病毒分离株和9株CVA16病毒分离株,进行VP1区基因扩增,并进行核苷酸序列和遗传进化关系分析。结果共检测HFMD疑似病例1 853例,总阳性率为70.91%(1314/1853),其中EV71占49.10%,CVA16占21.61%,EV71和CVA16双阳性占0.91%,其他肠道病毒(EV)占28.46%。16株EV71分离株与C4a亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性(97.3%～99.1%),属于C4a基因亚型;9株CVA16分离株与B1b亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性(94.9%～95.4%),属于B1b基因亚型。结论 2011年引起天津市HFMD的EV71型病毒流行株为C4a基因亚型,CVA16型病毒流行株为B1b亚型,并兼有一定比例的其他肠道病毒。     

山东省部分地区脑炎与非脑炎手足口病肠道病毒71型VP1区基因特征

目的采用逆转录-聚合酶链反应-序列分析方法,对脑炎与非脑炎手足口病患儿粪便和脑脊液样本中肠道病毒71型(EV71)部分VP1区进行核苷酸和氨基酸序列比对,探讨核苷酸或氨基酸变异与不同临床类型的关系。方法以临床诊断和基因诊断方法确定手足口病和EV71感染,用自行设计的2对引物,在EV71 VP1区扩增核苷酸,连接T载体后进行序列分析。所得序列连接后与EV71各亚型和安徽阜阳流行株核苷酸序列,通过DNAMAN和BI-OEDIT软件比对,分析其基因特征,并构建系统发生树。结果 6个不同临床类型手足口病病人核苷酸序列与A型、B型、C型的同源性分别为82.2%～82.6%、82.9%～84.1%和89.1%～95.1%,其中与C4亚型同源性最高,为94.8%～95.1%,与安徽阜阳地区流行株的同源性在98.0%～98.4%之间;与安徽阜阳株氨基酸序列比对,同源性在99.3%～99.6%之间,且均在563位由I(异亮氨酸)变为T(苏氨酸),仅有1例脑炎病人zxuan_VP1_2438-3260(脑脊液)在584位A(丙氨酸)变为G(甘氨酸),1例HFMD病人A06_B816064.VP1_2438-3227(粪便)在736位由W(色氨酸)变为C(半胱氨酸),余未出现特征性改变。结论神经源性肺水肿、脑炎与非脑炎手足口病患儿分离株EV71 VP1区核苷酸序列和推导的氨基酸序列无特征性差异。     

2010年福建省肠道病毒71型分离株的基因型特征研究

摘 要:目的 全面研究和了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,分析和探讨肠道病毒71型在我省的基因型地理分布特征及传播特征。方法 对2010年福建省9个设区市的 50株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 2010年福建省50株EV71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891个bp,核苷酸及氨基酸序列同源性比较,50株EV71型分离株之间的VP1区核苷酸序列同源性为95.4%-100%,编码蛋白氨基酸序列同源性为97.3%-100%,与08年阜阳流行株Fuyang17.08-2同源性最高,核苷酸序列同源性为97.1%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.7%-100%;VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08-2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论 2010年福建省50株EV71型分离株均属于C4a基因亚型,未产生明显的抗原漂移及变异;福建省及各个地市均分布亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒,应加强长期动态地监测和分析。关键词:肠道病毒71型;VP1区;基因型特征;     

新疆兵团第五师手足口病流行病学及病原学特征分析

目的 分析新疆生产建设兵团(简称兵团)第五师手足口病实验室检测结果,了解手足口病流行病学及病原学特征.方法 2011-2019年采集兵团第五师疑似手足口病患者粪便标本133份,应用荧光RT-PCR方法检测肠道病毒(HEV)、肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、柯萨奇病毒A组6型(Cox A6)和柯萨奇病毒A组10型(CoxA10)的特异性核酸,选取部分阳性标本扩增VP1序列、测序并分析序列.结果 133份标本,检出阳性123份,临床标本实验室检测总阳性率92.48％;患者男性多于女性,1～5岁病例最多(109例、占81.95％);4月开始发病并呈上升态势至6月后逐渐下降,5-8月为发病高峰期;核酸检测肠道病毒病原分型以CoxA16 (46.34％)、EV71(23.58％)和Cox A6(17.89％)为主,其他未分型占12.19％;病毒VP1基因序列分析,病例标本中CoxA16均属B1b亚型、Cox A6均属D2亚型,与国内近年某些地区流行株有较近亲缘关系.结论 兵团第五师手足口病主要以EV 71,CoxA16和Cox A6感染为主,存在感染人群年龄组和季节性差异;应根据当地手足口病流行病学及病原学特征制定政策,强化当地手足口病防控措施.     

2016-2018河北地区儿童病毒性脑炎流行特征调查北大核心CSCD

目的了解河北地区儿童病毒性脑炎病原谱和分子进化特征。方法收集2016-2018年河北地区351例诊断为病毒性脑炎的患儿的临床资料。采用实时荧光定量PCR检测脑脊液中病原,并利用PCR扩增肠道病毒VP1基因序列片段。对柯萨奇病毒B5型测序并利用软件MEGA6.0绘制种系发生树,采用邻位相连法构建进化树。结果351例患者中,学龄前儿童247例占70.37%。其中发热312例、287例头痛.228例呕吐或腹泻.61例咽痛或有呼吸道症状.23例嗜睡、皮疹9例和惊厥3例。351份脑脊液样品中102份样品检测结果为阳性,阳性率29.06%。其中单--感染101例,双重感染1例。102份样本中,检出EVs 72份,VZV 15份,HSV 10份,检出HHV63份,EBV与EV合并感染检出1份。72份肠道病毒样本中全部为肠道病毒B群,未检出肠道病毒A群。31株CVB5、18株Echovirus 30、3株CVB3.3株Echovirus9、2株CVB2.1株CVB1。31株CVB5与其他中国株之间VP1核苷酸同源性90.1%~99.5%,氨基酸同源性92.8%~99.7%;18株Echovirus30与其他中国株之间VP1核苷酸同源性91.6%~98.7%,氨基酸同源性95.3%~99.2%。系统进化分析显示CVB5均在C分枝上。结论发热和头痛是病毒性脑炎患儿的主要临床特征,肠道病毒是主要病原体。CVB5与其他中国株在同一分枝,说明亲缘关系较近。     

新疆生产建设兵团手足口病柯萨奇病毒A6型的流行及其基因特征分析

目的了解新疆生产建设兵团地区柯萨奇病毒A6(CVA6)的流行特点并对其基因特征进行分析。方法对2014-2016年新疆生产建设兵团地区收集的手足口病非肠道病毒71型(EV71)非柯萨奇病毒A16型(CVA16)阳性标本进行CVA6荧光定量PCR检测,采用RT-PCR扩增CVA6阳性标本中VP1编码区基因,并进行核苷酸序列测定与分析;利用MEGA6.06与GenBank代表株进行核苷酸同源性分析并构建系统进化树。结果2014-2016年采集的CVA6阳性标占在非EV71非CVA16阳性标本的82.39%,68株CVA6流行株之间VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%~100.0%和98.9%~100.0%,系统发育树显示97条CVA6序列共形成A-D 4个分支,其中D分支进一步分为D1-D3 3个亚分支。CVA6流行株中的5株处于D2亚分支,63株处于D3亚分支。结论新疆生产建设兵团地区2014-2016年手足口病非EV71非CVA16肠道病毒以CVA6为主,基于VP1系统发育分析分为A-D 4个分支,D分支中的D2和D3亚分支并存,其中D3亚分支是优势流行株。     

2016-2018河北地区儿童病毒性脑炎流行特征调查

目的了解河北地区儿童病毒性脑炎病原谱和分子进化特征。方法收集2016-2018年河北地区351例诊断为病毒性脑炎的患儿的临床资料。采用实时荧光定量PCR检测脑脊液中病原,并利用PCR扩增肠道病毒VP1基因序列片段。对柯萨奇病毒B5型测序并利用软件MEGA6.0绘制种系发生树,采用邻位相连法构建进化树。结果351例患者中,学龄前儿童247例占70.37%。其中发热312例、287例头痛、228例呕吐或腹泻、61例咽痛或有呼吸道症状、23例嗜睡、皮疹9例和惊厥3例。351份脑脊液样品中102份样品检测结果为阳性,阳性率29.06%。其中单一感染101例,双重感染1例。102份样本中,检出EVs 72份,VZV 15份,HSV 10份,检出HHV 6 3份,EBV与EV合并感染检出1份。72份肠道病毒样本中全部为肠道病毒B群,未检出肠道病毒A群。31株CVB5、18株Echovirus 30、3株CVB3、3株Echovirus 9、2株CVB2、1株CVB1。31株CVB5与其他中国株之间VP1核苷酸同源性90.1%～99.5%,氨基酸同源性92.8%～99.7%;18株Echovirus 30与其他中国株之间VP1核苷酸同源性91.6%～98.7%,氨基酸同源性95.3%～99.2%。系统进化分析显示CVB5均在C分枝上。结论发热和头痛是病毒性脑炎患儿的主要临床特征,肠道病毒是主要病原体。CVB5与其他中国株在同一分枝,说明亲缘关系较近。     

2008年上海及周边地区婴幼儿手足口病病原学研究

目的 了解2008年上海及周边地区婴幼儿手足IZl病病原体分布情况及其基因特征.方法 采集2008年5月至6月手足口病流行期间复旦大学附属儿科医院及浙江省德清市住院患儿咽拭标本,部分患儿同时采集脑脊液标本,分别接种于Vem、MRC-5及RD细胞进行病原体分离,RTPCR检测肠道病毒属、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、肠道病毒71型(EV71),并对扩增产物测序鉴定.结果 100例患儿的107份咽拭和22份脑脊液标本中,共计50例患儿的咽拭标本致细胞病变,经鉴定肠道病毒感染37例,占74.0%,其中EV71为26例,占52.0%(26/50例),CoxAl6为10例,占20.0%(10/50例),其他肠道病毒(CoxB3)1例,占2.O%(1/50例);肠道病毒属外的其他病原体13例,占26.0%,且其中1例患儿的脑脊液标本致Vero细胞病变.所有26例EV71病毒株与2008年中国浙江省及安徽省阜阳市EV71病毒株相似,同属于C基因型;10例CoxA16病毒株均属于C遗传世系.结论 手足口病病原复杂,2008年上海及周边地区婴幼儿手足口病的主要病原体仍是EV71和CoxA16,但尚存在一定比例的其他未知病原体.     

2010年上海地区肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析

目的 了解2010年上海地区手足口病患者中肠道病毒71型(EV71)分离株VP1区基因特征.方法 选取2010年不同时间的轻症与重症病例EV71分离株18株,对其抗原决定簇部位VP1区进行核苷酸序列测定、比对,并与美国国立生物技术信息中心公布的EV71 A、B、C各基因型分离株序列进行比对,构建系统发生树.结果 上...     

ECHO20病毒株KM/EV20/2010的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的分离并鉴定2010年云南省昆明市甲型肝炎患儿粪便标本中混存的ECHO20(Echovirus 20,ECHO20)KM/EV20/2010病毒株,分析其VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对大便标本进行病毒分离;采用微量细胞病变法,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对该分离株进行鉴定;采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因并进行序列测定,并运用Mega 4.0等软件进行分析处理。结果分离毒株经微量中和试验鉴定为ECHO20血清型,编号为KM/EV20/2010;经RT-PCR法扩增获得为867bp的VP1基因,与国内分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79.5%~91.7%和98.9%~99.6%,与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.2%~83.2%和96.4%~99.6%;在进化树上云南分离株与GenBank中登录的中国国内2001年山东分离株01352和1998年法国分离株94CF1666形成一个进化分支。结论 KM/EV20/2010分离株为肠道病毒ECHO20型病毒,可用KMB17人二倍体胚肺成纤维细胞分离增殖。     

一起儿童病毒性脑炎暴发肠道病毒ECHO6型分离株VP1基因特征分析

目的 对埃可病毒6型(ECHO6)福建龙岩分离株进行分子生物学分析,阐明ECHO6病毒福建龙岩分离株的分子生学特征及其与世界其它分离株的基因关系。方法 采集暴发病例脑脊液标本,用RD细胞进行分离病毒,阳性分离物采用中和试验及PCR序列分析确定其血清型别;RT-PCR扩增VP1基因全长,测定序列进行同源性及亲缘进化树分析。结果 13例细胞培养阳性分离物经中和试验及序列分析结果均为ECHO6。随机选取4株病毒株进行VP1全基因序列分析显示: 4个病毒株之间同源性＞99%;与山东病毒株E6/SD/sewage/081226/2-2同源性高于其他参考株。在遗传进化树上,4株分离病毒株同属一个分支, 为C2亚型。结论 ECHO6是引起本次福建省龙岩市长汀县儿童病毒性脑炎暴发的病原体,其基因型为C2亚型。     

2017年南京市2株肠道病毒71型分离株全基因组序列测定分析

目的 对2017年南京市2株肠道病毒71型分离株进行全基因组序列测定,分析其进化及遗传变异特征,为手足口病疫情的监控与防治提供依据。方法 通过对临床检测EV71阳性的标本进行病毒分离,设计8对特异性引物对病毒全基因组进行PCR分段扩增,经序列测定及拼接获得EV71基因组序列,将其与其他代表毒株序列分别进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并进行遗传进化分析。结果 基因组核苷酸同源性分析显示,2株分离株的同源性为94.0%。以EV71 NJ2017iso2作为参照,与2008年安徽流行株Fuyang 17.08-02的同源性最高(96.9%),而与原型株BrCr的同源性较低(79.8%)。同时基于VP1基因和全基因组序列构建的进化树均可以看出,2株分离株与C4亚型代表株聚为一簇,与国内各地既往的C4流行毒株相比,未发生大的变异。结论 2株EV71分离株均属于C4a型,虽病毒核苷酸序列之间差异显著,但大多为无明显的突变,其相应的氨基酸序列的遗传变化相对稳定。     

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的 全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征,分析EV71型病毒在湖北省的基因型别,探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法 对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析,并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果 2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型,其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高,分别为96.5%～98.7%和98.3%～100%。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主,其次为β片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论 2011年湖北省EV71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性,且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71 VP1的二级结构和三级结构,为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。     

福州地区2012年柯萨奇A6型肠道病毒分子特征分析

目的对2012年福州地区分离的其他肠道病毒CVA6进行分子鉴定,并对其VP1部分序列进化分析。方法肛拭子标本采用RD细胞进行病毒分离,通过RT—PCR对分离株的VP1部分序列进行扩增、克隆和测序;经过Blast程序比对来确定病毒的基因型;通过Mega4．0软件对不同病毒株VP1部分序列的差异进行比较。结果从10份其他肠道病毒患者的肛拭子标本中分离到6株CVA6病毒。测序结果显示,该6株CVA6病毒核苷酸序列具有高度一致性,但与福州周边国家或地区CVA6的核苷酸一致性为91．8％～97．3％。结论2012年福州市HFMD的病源除Ev71和CVA16外,还包含CVA6病毒。序列分析表明,因此,应加强对手足口病例中其他肠道病原体的检测,并掌握其流行以及病毒遗传进化特征,为HFMD的防控提供科学依据。     

Direct Identification of Enteroviruses in Cerebrospinal Fluid of Patients with Suspected Meningitis by Nested PCR Amplification

Enteroviruses, the most common human viral pathogens worldwide, have been associated with serous meningitis, encephalitis, syndrome of acute flaccid paralysis, myocarditis and the onset of diabetes type 1. In the future, the rapid identification of the etiological agent would allow to adjust the therapy promptly and thereby improve the course of the disease and prognosis. We developed RT-nested PCR amplification of the genomic region coding viral structural protein VP1 for direct identification of enteroviruses in clinical specimens and compared it with the existing analogs. One-hundred-fifty-nine cerebrospinal fluids (CSF) from patients with suspected meningitis were studied. The amplification of VP1 genomic region using the new method was achieved for 86 (54.1%) patients compared with 75 (47.2%), 53 (33.3%) and 31 (19.5%) achieved with previously published methods. We identified 11 serotypes of the Enterovirus species B in 2012, including relatively rare echovirus 14 (E-14), E-15 and E-32, and eight serotypes of species B and 5 enteroviruses A71 (EV-A71) in 2013. The developed method can be useful for direct identification of enteroviruses in clinical material with the low virus loads such as CSF.