新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的探讨新生大鼠心肌细胞分离与培养的条件和方法,建立简单、可靠的原代心肌细胞培养方法。方法新生SD乳鼠10只,开胸取心剪碎后,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化心肌组织,差速贴壁法纯化心肌细胞。倒置荧光相差显微镜下连续观察15 d心肌细胞形态特征及变化。用0.4%锥虫蓝染色测心肌细胞存活率,记录心肌细胞搏动次数。结果心肌细胞24 h基本贴壁并伸出伪足,出现自发性搏动,72 h后心肌细胞逐渐形成细胞簇,并呈现部分同步搏动,之后心肌细胞连接成片生长。心肌细胞存活率为96.5%,培养72 h至第15天内心肌细胞搏动次数无差异(P>0.05)。结论用该法分离与培养新生大鼠心肌细胞,操作简单且稳定可靠,心肌细胞存活率较高。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法：无菌条件下取出出生1~2 d的SD大鼠心脏,用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L Ⅱ型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90 min纯化心肌细胞,48 h后换液。结果： 将心肌细胞24 h贴壁生长,于2~3 d心肌细胞伸出伪足,形成细胞簇,同步搏动,频率约80~130次/min,存活率为（93.9±2.8）%,纯度为（91.9±2.2）%。结论：以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良

目的改良简化心肌细胞培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的新生SD大鼠的心肌细胞。方法采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌、差速贴壁1 h纯化心肌细胞进行培养,全过程在37℃条件下进行。于培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,并在生物倒置显微镜下观察形态学变化。取培养48 h的细胞,用免疫组织化学染色的方法检测心肌细胞的纯度。结果心肌组织在6 h时基本消化完全。培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于95%,培养30 d时仍为95.2%。在生物倒置显微镜下观察,培养24 h左右的细胞之间形成交联并有细胞搏动。培养48h的细胞经免疫组织化学染色法测定,心肌细胞的纯度为（97.1±1.9）%。结论应用改良并简化的心肌细胞培养方法和培养条件,可得到纯度和存活率均高能满足大多数科研要求的原代乳鼠心肌细胞。     

低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞

目的观察低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞的结果。方法分离SD大鼠颌面部咬肌区肌肉组织,先用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化后再用0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.125%的胰蛋白酶(1∶1)低浓度混合酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化,所得细胞进行结蛋白(Desmin)免疫组化染色。结果体外培养所得细胞Desmin胞质阳性率达95%。结论采用低浓度混合酶消化和差速贴壁法体外培养SD大鼠面颌肌细胞可获得纯度高、产量高、活性强、稳定性好的面颌肌细胞。     

基于密度梯度法分离纯化的改良培养新生小鼠心肌细胞方法研究

目的基于Percoll不连续密度梯度法分离纯化心肌细胞,建立一个快速稳定提取新生小鼠心肌细胞的原代培养方法。方法在无菌状态下取C57BL/6乳鼠心室,用低浓度Ⅱ型胶原酶消化,通过调整温度、消化方式、离心时间及转速,采用Percoll密度梯度法分离纯化心肌细胞。观察不同时间心肌细胞形态;用0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率及细胞数量;采用免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况,鉴定心肌细胞及其纯度。结果 5次培养结果显示,心肌细胞的平均存活率为(93.12±0.75)%,纯度为(96.36±0.60)%,细胞生长状态良好,可以贴壁自发搏动。结论采用本方法能获得产量、存活率及纯度很高的新生小鼠原代心肌细胞,耗时较短,是一种理想的分离纯化原代心肌细胞的方法,可满足后续各种实验要求。     

新生大鼠心肌细胞培养方法的改进

目的:建立便捷,成熟的新生大鼠心肌细胞体外培养方法。方法:本实验对常用的培养方法加以改进,采用胰蛋白酶及Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶共同消化法,分离新生大鼠心肌细胞,并对体外培养的心肌细胞的存活率、活力及纯度进行鉴定。结果:分离的心肌细胞存活率为96%,培养3 d后有60%~80%的细胞开始搏动,搏动频率平均50次/min,心肌细胞纯度在75%以上。结论:本实验建立的新生大鼠心肌细胞体外培养方法是成熟,可靠的。     

大鼠乳鼠心房肌细胞的分离和培养

目的探讨Wistar大鼠乳鼠心房肌细胞的原代分离及培养方法,为细胞电生理或房性心律失常的研究提供心房肌细胞。方法取出生1~3 d的Wistar大鼠的乳鼠,分离心室和心房,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化分离的心房肌组织,差速贴壁法分离心房肌细胞与成纤维细胞,并加入0.5ml Brd U纯化心房肌细胞。高糖培养基培养心房肌细胞,显微镜下观察心房肌细胞形态,通过免疫荧光法测定心房肌细胞纯度。结果成功分离培养心房肌细胞并观察其形态,纯度为94.3%±1.4%,3~4 d出现同步搏动。结论应用差速贴壁法并加用Brd U,可以进一步纯化胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分离的心房肌细胞。     

乳鼠心肌细胞的原代培养

目的 :观察原代培养的乳鼠心肌细胞的形态学特征。方法 :使用 型胶原酶、胰蛋白酶和 DNase 消化心脏组织 ,差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。结果 :第 1天心肌细胞几乎全部贴壁 ,少数细胞出现自发性搏动 ;第 3天形成细胞簇或细胞单层 ,收缩明显而有力 ;透射电镜可见肌小节、Z线、闰盘 ;良好的形态和活力可维持2 0 d。结论 :使用 型胶原酶、胰蛋白酶和 DNase 分离培养心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞 ,该方法值得进一步推广。     

乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外分离培养方法的优化

目的优化SD乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的体外分离培养的条件和方法。方法分别用胰酶、Ⅱ型胶原酶依次消化分离心肌组织,再通过两次差速贴壁分离法分别收集、培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞。光学显微镜下分别观察心肌细胞和心肌成纤维细胞的基本形态特征的变化,原代心肌细胞行心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定,而心肌成纤维细胞则用第2代行波形蛋白免疫荧光鉴定。结果心肌细胞在2~4 h开始贴壁生长,12~24 h贴壁速率大幅增加,并出现自发性搏动,48~72 h心肌细胞粘合成簇,细胞成活率,纯度均达95%以上;心肌成纤维细胞第2~4代细胞生长良好,纯度高达98%以上。结论此种方法可得到产量大,纯度高,活力好的心肌细胞和心肌成纤维细胞,为心血管疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

Wistar大鼠乳鼠与成年鼠心室肌细胞的分离与性质鉴定

目的 探索和优化稳定的适于电生理实验研究的乳鼠及成年大鼠心室肌细胞分离方法。方法 切碎乳鼠心室肌,胰蛋白酶消化,差速贴壁2 h纯化心室肌细胞,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,体外培养48 h后分别行倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化鉴定,微电极阵列记录细胞搏动频率和场电位。采用Langendorff灌流成年大鼠心脏,主动脉逆行插管,胶原酶域反复灌流消化约30 min,无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心室肌组织,台氏液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,将细胞悬液用逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,用于膜片钳记录。结果 经4 -6次消化后,乳鼠心室组织消化完全,细胞存活率大于80%。倒置显微镜下观察,细胞呈梭形、多角形。 12 h有少部分细胞搏动,48 h细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30 - 80次/分。 琢鄄辅肌动蛋白（琢鄄actin）经免疫组化检测,纯度达96%。 Langendorff灌流酶解法可获得形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整、立体感强的单个成年鼠心肌细胞,存活率85%,复钙后存活率50%,可用于膜片钳记录。结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的用于电生理检测的心室肌细胞。