全反式视黄酸诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

目的　探讨梯度浓度全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,ATRA）诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的作用。方法　采用流式细胞术检测视网膜色素上皮细胞凋亡、活性氧（ROS）活性。采用实时定量聚合酶链反应和Western blot，从蛋白水平检测梯度浓度ATRA对ARPE-19细胞内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）标记蛋白表达的影响。观察抗氧化剂NAC及ERS抑制剂Salubrinal抑制ARPE-19细胞诱导ROS和ERS的作用。结果　CCK-8检测结果显示:ATRA处理ARPE-19细胞24 h和48 h后的半抑制浓度（IC₅₀）分别为13.88 μmol?L^-1和11.99 μmol?L^-1。流式细胞术检测结果显示，10.0 μmol?L^-1、15.0 μmol?L^-1、20.0 μmol?L^-1ATRA处理后细胞凋亡水平均较对照组显著上升，差异均有统计学意义（均为P<0.001）；2.5 μmol?L^-1、5.0 μmol?L^-1、10.0 μmol?L^-1、20.0 μmol?L^-1ATRA处理后细胞的ROS水平均较对照组显著增加，差异均有统计学意义（均为P<0.001）。Western blot检测结果显示，ERS标记蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBPhomologous protein,CHOP）、结合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BIP）的蛋白表达水平与对照组差异均有统计学意义（均为P<0.05）；经ATRA处理的模型组较对照组的血管内皮生长因子A(VEGF-A)、CHOP蛋白表达水平均显著上升，NAC-ARTA处理组、Salubrinal-ARTA处理组及NAC-Salubrinal-ARTA联合处理组较模型组的VEGF-A、CHOP蛋白表达水平均显著下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　ATRA通过激活ROS和ERS信号通路诱导ARPE-19细胞凋亡。     

miR-140-5p靶向Nrf2对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激的调节作用

目的　探讨miR-140-5p靶向核因子-类胡萝卜素2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）对高糖诱导的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞氧化应激的调节作用及对应的分子生物学机制。方法　使用5 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1、20 mmol·L^-1、30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1的葡萄糖分别处理ARPE-19细胞。利用CCK-8法及RT-qPCR检测各葡萄糖浓度下ARPE-19细胞的活力及miR-140-5p、Nrf2 mRNA表达情况。将miR-140-5p inhibitor、miR-140-5p-NC、miR-140-5p-mimic、si-Con或si-Nrf2转染入ARPE-19细胞,根据转染物和葡萄糖浓度不同分组,使用DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性试剂盒检测SOD活性;使用RT-qPCR检测不同处理的ARPE-19细胞Nrf2 mRNA表达情况,并通过荧光素酶报告基因实验对靶点进行验证。结果　与葡萄糖浓度为5 mmol·L^-1 时相比,30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1葡萄糖作用下ARPE-19细胞存活率显著降低（P<0.05、P<0.001）,而miR-140-5p相对表达量则明显升高（P<0.05、P<0.001）。与50 mmol·L^-1葡萄糖+miR-140-5p-NC处理组相比,50 mmol·L^-1葡萄糖+miR-140-5p inhibitor处理组细胞存活率显著增加,ROS含量显著降低,SOD活性显著增加（均为P<0.01）。与葡萄糖浓度为5 mmol·L^-1 时相比,30 mmol·L^-1、50 mmol·L^-1葡萄糖作用下ARPE-19细胞Nrf2 mRNA相对表达量均显著降低（P<0.01、P<0.001）。荧光素酶报告基因实验结果显示,与转染miR-140-5p-NC组相比,转染miR-140-5p-mimic组Nrf2相对荧光素酶活性显著降低,转染miR-140-5p-inhibitor组Nrf2相对荧光素酶活性显著增多,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。在50 mmol·L^-1葡萄糖浓度下,与转染miR-140-5p-inhibitor+si-Con的ARPE-19细胞比较,转染miR-140-5p inhibitor+si-Nrf2后ARPE-19细胞存活率降低,细胞内ROS含量增高,SOD活性下降（均为P<0.01）。结论　miR-140-5p可能通过靶向Nrf2调节高糖诱导的RPE细胞氧化应激作用。     

褪黑素联合锌对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨褪黑素（MT）联合锌（Zn）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE细胞株（ARPE-19）,利用不同浓度H₂O₂处理ARPE-19细胞,将细胞存活率接近50%的H₂O₂浓度作为氧化损伤浓度。将ARPE-19细胞分为:不同浓度MT（10^-5 mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-7mol·L^-1）+ZnCl₂（15 μmol·L^-1）组,ZnCl₂组（采用15 μmol·L^-1 ZnCl₂培养细胞）,H₂O₂组（不添加MT和ZnCl₂培养细胞）,空白对照组（细胞不做任何处理）。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用试剂盒测量各组细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。ELISA检测各组细胞内白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。结果　当H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1时,细胞存活率为(54.31±1.91)%,此时细胞存活率接近50%,后续实验中均选择该浓度作为氧化损伤浓度。ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞凋亡率分别为3.05%、1.17%、1.50%、1.71%,与空白对照组（0）相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.76倍、1.59倍、1.41倍,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.13倍和1.25倍,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组细胞内MDA的含量较空白对照组显著提高 （P<0.05）;ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内MDA的含量均较空白对照组稍增加,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1MT+ZnCl₂组和10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均略高于空白对照组,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　MT联合Zn能有效降低H₂O₂损伤所致ARPE-19细胞内ROS的含量,随之减少细胞内MDA的含量,同时也能抑制IL-6和TNF-α的表达量,从而起到保护RPE细胞的作用。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的　探讨纳豆激酶（NK）对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）损伤的保护作用。方法　不同浓度的葡萄糖和氯化钴（CoCl₂）诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1（ZO-1）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素（IL）-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组）、高糖+ CoCl₂组（25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200 μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组）和NK处理组（1.0 μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200 μmol·L^-1 CoCl₂,NK+HG+CoCl₂组）,采用Western blot和RT-qPCR检测各组ARPE-19细胞中ZO-1、HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平。结果　CCK-8法检测结果显示,与NC组比较,CoCl₂浓度高于200 μmol·L^-1的干预组中ARPE-19细胞的活性均明显降低（均为P<0.01）,且细胞形态发生明显改变。Western blot和RT-qPCR检测结果显示,与NC组比较,200 μmol·L^-1CoCl₂的干预组ARPE-19细胞中HIF-1α和VEGFA的蛋白和mRNA与IL-1β和IL-18的mRNA的表达水平均明显增加（均为P<0.01）,而ZO-1蛋白的表达水平均明显降低（均为P<0.05）。CCK-8法检测结果显示,当NK 浓度高于1.0 μmol·L^-1 时, ARPE-19细胞的活性较NC组均明显下降（均为P<0.01）。与HG+CoCl₂组比较,NK+HG+CoCl₂组ARPE-19细胞中HIF-1α、VEGFA蛋白和mRNA的表达水平均显著降低（均为P<0.001）,而ZO-1蛋白的表达水平明显上升（P<0.05）。结论　NK可以降低高糖缺氧损伤的ARPE-19细胞中HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平,对高糖缺氧引起的细胞损伤具有保护作用。     

自噬激活剂雷帕霉素对 A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的　探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（A2E）诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞自噬调节的影响。方法　取人RPE细胞（ARPE-19细胞系）进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用含20 μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组:使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组:使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20 μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测各组细胞自噬标志物LC3蛋白的表达。结果　与对照组相比,A2E组细胞生存率显著下降（P<0.001）,而雷帕霉素联合A2E组细胞生存率得到了部分恢复,与A2E组相比差异有统计学意义（P<0.01）。与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中10种细胞因子含量均有所下降（均为P<0.01）。与对照组相比,雷帕霉素组细胞内出现散在自噬囊泡,A2E组细胞内出现较多的自噬囊泡,而雷帕霉素联合A2E组细胞内出现大量聚集的大体积的自噬囊泡。与对照组相比,A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量显著升高（P<0.001）,P62蛋白相对表达量显著降低（P<0.001）;与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.01）,而P62蛋白相对表达量明显降低（P<0.001）。雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点大量聚集,与A2E组相比荧光强度增加,斑点体积更大,数量也更多。结论　雷帕霉素能够进一步激活A2E诱导的ARPE-19细胞自噬活性,一定程度上降低了A2E对RPE细胞造成的损伤,并抑制了ARPE-19细胞中炎症因子和血管生成因子的分泌。     

氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1（HINT1）表达的影响

目的　探讨过氧化氢（hydrogen peroxide,H₂O₂）诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化损伤对三联组氨酸核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotide binding protein 1,HINT1）表达的影响。方法　将人ARPE-19细胞系分别用0 μmol·L^-1 H₂O₂（对照组）、50 μmol·L^-1 H₂O₂、100 μmol·L^-1 H₂O₂、200 μmol·L^-1 H₂O₂、400 μmol·L^-1 H₂O₂、600 μmol·L^-1 H₂O₂ 6个浓度梯度处理。采用Live/Dead荧光双染法和MTT法分别检测细胞活力和增殖能力;采用Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2以及HINT1的表达水平。结果　H₂O₂处理6 h后,对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1及600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞死亡率分别为（0.35±0.11）%、（2.03±0.87）%、（3.76±1.41）%、（12.17±1.26）%、（17.69±2.24）%、（25.22±0.59）%,RPE细胞死亡率呈剂量依赖性升高（P<0.05）。H₂O₂作用后对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞生存率分别为（40.72±2.71）%、（37.75±0.62）%、（35.30±0.68）%、（34.10±0.74）%、（33.61±0.71）%、（31.05±1.41）%,RPE细胞增殖明显减少（P<0.05）,具有剂量-效应关系。随着H₂O₂浓度的增加,BAX蛋白表达逐渐上升（P<0.01）,而抗凋亡BCL-2蛋白表达则逐渐下降（P<0.01）,BAX/BCL-2比值相比对照组分别升高1.85倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.35倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.86倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、3.97倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、8.50倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）;HINT1在H₂O₂处理的RPE细胞中以剂量依赖性方式逐渐下降（P<0.01）,分别下降0.78倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.59倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.45倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.42倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.38倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）。结论　H₂O₂氧化损伤诱导RPE细胞活力显著减弱,细胞凋亡相关蛋白BAX表达升高;同时,细胞中HINT1表达下调,表明HINT1可能通过影响细胞凋亡参与年龄相关性黄斑变性的发生,为其药物作用的潜在靶点。     

α-硫辛酸对高糖条件下培养的人晶状体上皮细胞的保护作用

目的　探讨α-硫辛酸（alpha-lipoic acid,ALA）对高糖条件下培养的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3的保护作用。方法　将传代培养的HLEC-B3细胞分为正常对照组、高糖组、ALA组。正常对照组不做任何处理,ALA组HLEC-B3经过不同浓度ALA（25 μmol·L^-1、50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1）预处理1 h后,与高糖组一同置于高糖条件下培养48 h。经上述处理后,即刻采用MTT检测各组晶状体上皮细胞的活性,流式细胞仪检测各组细胞内线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的变化,Western blot和RT-PCR检测各组细胞内锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,MnSOD）的表达。结果　高糖组HLEC-B3细胞活性为53.60%±4.10%,较正常对照组显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）,25 μmol·L^-1、50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1 ALA组细胞活性分别为65.30%±3.70%、72.70%±4.90%、83.40%±3.60%,均较高糖组显著增高（均为P<0.05）;流式细胞仪检测结果显示,高糖组细胞内ROS水平较正常对照组明显增高（P<0.01）,各浓度ALA组ROS水平分别降低为14.70%±0.70%、8.70%±0.87%、5.20%±0.53%,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。RT-PCR及Western blot检测结果显示,高糖培养后细胞内MnSOD mRNA和蛋白相对表达量均较正常对照组显著降低（均为P<0.01）;与高糖组相比,不同浓度ALA组细胞内MnSOD mRNA相对表达量分别增高为0.63±0.06、0.71±0.06、0.84±0.04;MnSOD蛋白相对表达量分别增高为0.25±0.03、0.31±0.02、0.45±0.04,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。ALA对高糖诱导的HLEC-B3细胞损伤的保护作用呈一定的浓度依赖性。结论　ALA对高糖条件下培养的HLEC-B3具有一定的保护作用,且该保护作用可能是通过提高细胞内MnSOD的表达水平实现的。     

杞黄颗粒对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症损伤的保护作用

目的　探讨杞黄颗粒（QHG）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19炎症损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE-19细胞,随机分为对照组、H₂O₂损伤组(200 μmol?L^-1 H₂O₂处理细胞）、QHG低剂量组（1 g?L^-1 QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）和QHG高剂量组（2 g?L^-1QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）。使用相差显微镜观察各组ARPE-19细胞形态;流式细胞仪检测各组ARPE-19细胞凋亡率,Real-time PCR检测各组ARPE-19细胞β淀粉样蛋白（Aβ)mRNA表达,ELISA检测各组ARPE-19细胞Aβ以及攻膜复合物（MAC）的蛋白表达水平。结果　相差显微镜下可见,QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞形态改变均较H₂O₂损伤组轻。对照组、H₂O₂损伤组、QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞凋亡率分别为（6.85±0.14）%、（43.60±1.80）%、（23.23±1.43）%、（17.90±0.78）%,H₂O₂损伤组细胞凋亡率较对照组明显增加,QHG低剂量组及QHG高剂量组细胞凋亡率均较H₂O₂损伤组明显降低,且QHG高剂量组较QHG低剂量组降低更明显,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组相比,H₂O₂损伤组ARPE-19细胞Aβ mRNA及Aβ、MAC蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比,QHG低剂量组及QHG高剂量组均可明显降低ARPE-19细胞Aβ mRNA 相对表达量及Aβ、MAC蛋白的表达水平,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。结论　QHG能有效抑制H₂O₂诱导的人RPE细胞凋亡,减少细胞Aβ及MAC表达,从而起到保护人RPE细胞的作用。     

潜伏转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）对氧化型低密度脂蛋白诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的　探索潜伏转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的影响。方法　0 mg·L^-1 、50 mg·L^-1 、100 mg·L^-1 和200 mg·L^-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞,CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋亡水平,Western blot检测不同浓度ox-LDL处理后细胞LTBP2蛋白表达水平。100 mg·L^-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞构建氧化损伤模型。将ARPE-19细胞随机分为对照组,ox-LDL组,转染LTBP2过表达载体或阴性对照的ox-LDL+ov-LTBP2组和ox-LDL+ov-NC组,转染LTBP2 siRNA或阴性对照的ox-LDL+si-LTBP2组和ox-LDL+si-NC组,以及ox-LDL+ si-LTBP2 +VEGF组。相应处理各组细胞后,采用CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋亡水平,酶联免疫吸附实验检测氧化应激标志物活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平,Western blot检测各组细胞LTBP2、P38和p-P38的蛋白表达水平。结果　与0 mg·L^-1 ox-LDL处理后相比,50 mg·L^-1 、100 mg·L^-1 和200 mg·L^-1 ox-LDL处理后APRE-19细胞活力下降,凋亡率升高,LTBP2蛋白表达水平增加,且变化均具有剂量依赖性（均为P<0.05）。与ox-LDL + ov-NC 组相比,ox-LDL+ ov-LTBP2组细胞LTBP2蛋白表达水平、ROS含量及细胞凋亡率均增加,细胞活力、SOD活性均降低,p-P38/P38比值和VEGF表达量均增加 （均为P<0.05）。与ox-LDL+si-NC组相比,ox-LDL+si-LTBP2组细胞LTBP2蛋白表达水平、ROS含量及细胞凋亡率均降低,细胞活力、SOD活性均增加,p-P38/P38比值和VEGF表达量均减少（均为P<0.05）。而与ox-LDL+ si-LTBP2组比较,ox-LDL+ si-LTBP2+VEGF组细胞凋亡率和ROS含量均增加,细胞活力、SOD活性均降低（均为P<0.05）。结论　LTBP2通过激活P38 MAPK信号通路促进VEGF表达加剧ox-LDL引起的ARPE-19细胞氧化应激损伤。     

槲皮素对转化生长因子β1介导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化过程的影响

目的　探讨槲皮素对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、迁移、I型胶原蛋白含量、上皮-间质转化相关标志物表达以及Smad信号通路的影响。方法　取人RPE细胞系（ARPE-19细胞）进行培养,依据干预药物浓度筛选结果设置4个组:对照组、10.0 mg·L^-1TGF-β1组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组,ARPE-19细胞在4种不同的条件下培养24 h和48 h。采用CCK-8法测定各组细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移情况,ELISA检测细胞中I型胶原蛋白含量,Western blot 检测各组细胞上皮-间质转化标志物表达情况及Smad2/3磷酸化情况。结果　处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞存活率均高于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞存活率高于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞迁移数均多于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞迁移数多于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,培养基上清液I型胶原蛋白含量升高（P<0.05）,而加入不同浓度槲皮素均能够有效抑制I型胶原蛋白含量的升高（均为P<0.05）。槲皮素以浓度依赖的方式显著降低了TGF-β1所引起的N-钙黏合素和α平滑肌肌动蛋白的表达增高作用;槲皮素可以使紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素的表达增高。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,Smad2/3磷酸化显著增加,而槲皮素可以抑制Smad2/3磷酸化。结论　槲皮素能够显著抑制TGF-β1介导的RPE细胞增殖、迁移和胶原分泌,通过调节Smad2/3磷酸化来抑制TGF-β1介导的RPE细胞的上皮-间质转化过程。     

氧化应激诱导视网膜色素上皮细胞中钙蛋白酶激活作用研究

目的　观察一定浓度H₂O₂氧化应激体外培养人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE） 细胞中钙蛋白酶（Calpain）含量及细胞活性改变。方法　常规培养商品化人RPE细胞系ARPE-19作为对照组,培养基内加入终浓度为10 μmol·L^-1 及 100 μmol·L^-1的H₂O₂作为实验组,培养4 h、8 h、16 h及32 h进行测定。MTT法测定不同浓度H₂O₂刺激下RPE细胞不同检测时间点细胞增殖率的变化;Fluo-3/AM、ester钙离子荧光探针标记细胞内钙离子,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测RPE细胞内钙离子荧光值,间接观察钙离子浓度变化。10 μmol·L^-1 H₂O₂氧化刺激RPE细胞8 h,用Western-Blot法及实时荧光定量PCR法检测细胞内Calpain蛋白及RNA含量的变化。结果　与对照组相比,10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h、8 h、16 h及100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞4 h及8 h后增殖率（r值） 升高差异均具有显著统计学意义（均为P<0.01）。100 μmol·L^-1 H₂O₂刺激16 h及32 h细胞增殖率均较对照组下降（均为P<0.01）。10 μmol·L^-1 H₂O₂刺激RPE细胞8 h后胞内钙离子荧光强度（563.27±77.10）U较对照组（170.77±20.11）U显著升高（P<0.01）、Calpain在mRNA和蛋白水平均较对照组显著升高（均为P<0.05）,而在同时使用Calpain抑制剂SNJ-1945（SNJ）的实验组这些变化可被有效抑制。结论　RPE细胞中钙超载激活Calpain参与H₂O₂氧化刺激RPE细胞的氧化应激改变。     

四君子汤含药血清抑制晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的　观察四君子汤含药血清对人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cell，HLEC）凋亡的抑制作用，从而探讨四君子汤防治老年性白内障的机制。方法　30只SD大鼠随机分为2组，分别用四君子汤（1.725 g·kg^-1·d^-1）和生理盐水灌胃，用药7 d后经腹主动脉采血，离心提取四君子汤含药血清和空白血清冻存备用。细胞实验分为4组:阴性对照组、过氧化氢组（300 μmol·L^-1过氧化氢作用4 h）、空白血清组（300 μmol·L^-1过氧化氢作用4 h后加入体积分数20%空白血清作用12 h）和四君子汤含药血清组（300 μmol·L^-1过氧化氢作用4 h后加入体积分数20%四君子汤含药血清作用12 h），流式细胞仪检测HLEC细胞周期；透射电子显微镜观察各组HLEC超微结构的改变。结果　流式细胞仪检测结果示:过氧化氢组G1期细胞比例为（67.127±2.615）%，较阴性对照组明显增加，S期细胞比例为（24.603±2.547）%、 G2期细胞比例为（8.270±1.149）%，均较阴性对照组减少，差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）。四君子汤含药血清组G1期细胞比例为（41.517±20.008）%，较过氧化氢组明显减少，S 期细胞比例为（38.423±10.213）%、G2期细胞比例为（20.060±11.004）%，均较过氧化氢组明显增加，差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）。透射电子显微镜结果显示:阴性对照组胞膜完整，各细胞器结构正常；过氧化氢组细胞表面微绒毛消失，染色质凝集成块分布于核膜下，核膜欠完整，细胞质内可见溶酶体；空白血清组细胞质内空泡增多，线粒体、内质网等细胞器结构仍可见；四君子汤含药血清组胞膜完整，细胞质内可见少许空泡，线粒体、内质网等细胞器结构清晰。结论　四君子含药血清能有效抑制过氧化氢诱导的HLEC凋亡，这可能是四君子汤防治老年性白内障的机制之一。     

不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1和基质金属蛋白酶9表达的影响

目的　探讨不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表达的影响及其调节作用。方法　SD大鼠右眼制备成角膜碱烧伤模型，随机分为对照组、0.5 g·L^-1多西环素组和1.0 g·L^-1多西环素组，每组15只。3组分别于造模后每天给予20 μL眼液溶媒、0.5 g·L^-1多西环素、1.0 g·L^-1多西环素滴眼至观察期末。于碱烧伤后第3天、第7天、第14天对角膜混浊程度进行评分，并行RT-PCR和ELISA检测角膜组织中TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白的表达情况。结果　与对照组相比，碱烧伤后第7天、第14天，0.5 g·L^-1多西环素组［（2.80±0.45）分、（2.20±0.45）分］和1.0 g·L^-1多西环素组［（2.00±0.00）分、（0.60±0.55）分］角膜混浊程度评分降低，且1.0 g·L^-1多西环素组更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天、第14 天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组TGF-β1 mRNA及蛋白表达量均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组MMP-9 mRNA及蛋白表达均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　多西环素可下调碱烧伤大鼠角膜中TGF-β1和MMP-9的表达，促进角膜愈合，并呈一定程度的剂量依赖性。