银杏叶提取物对H2O2诱导的晶状体上皮细胞Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察银杏叶提取物(EGb761)对晶状体上皮细胞凋亡相关基因蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法:将离体培养的SD大鼠的晶状体上皮细胞分成3组:实验组用H2O2 EGb761处理,对照组用H2O2处理,空白对照组未做任何处理。用免疫组化的方法检测上皮细胞Bcl-2,Bax的表达,分析实验组、对照组和空白对照组的表达情况。结果:Bcl-2蛋白表达的阳性细胞率:实验组随时间的延长而上升,24h时为(20.7±1.4)%,对照组则随时间的延长而下降,24h时为(2.6±0.6)%,空白对照组为(6.8±1.1)%;Bax蛋白表达的阳性细胞率:实验组随时间的延长无明显变化,24h时为(10.7±0.9)%;对照组则随时间的延长而上升,24h时为(33.4±4.6)%,空白对照组为(4.6±0.8)%。结论:EGb761通过使晶状体上皮细胞Bcl-2蛋白表达增加,Bcl-2/Bax减少,阻止氧化损伤所致的晶状体上皮细胞凋亡;细胞凋亡可能与白内障形成有关,EGb761在早期白内障形成中可能起抑制作用。     

环氧合酶-2在bFGF诱导的人晶状体上皮细胞增殖中的表达

目的检测环氧合酶-2(cyclooxygenase，COX-2)在人晶状体上皮细胞(human lens epithelium cell，HLEC)中的表达，探讨COX-2在后发性白内障(PCO)形成中的意义。方法细胞传代培养，取第三代细胞用于实验。用SP免疫组化法检测bFGF刺激6小时后COX-2蛋白的表达，并与对照组相比较，以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达；采用RT—PCR和Western—blot方法检测bFGF刺激下，不同时间点(1h、3h、6h、12h、24h)COX-2的mRNA和蛋白的表达。结果检测的人晶状体上皮细胞中，实验组的细胞COX-2mRNA和蛋白表达均为阳性。且表达呈时间依赖性，随着时间的延长COX-2表达逐渐增加，6h达最高峰；正常对照组表达弱或无表达。结论bFGF可以刺激晶状体上皮细胞增殖，并诱导环氧合酶-2的表达，提示COX-2与人晶状体上皮细胞的增殖密切相关。COX-2可能参与PCO的形成。     

不同浓度17β-雌二醇对雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度17β-雌二醇对H2O2诱导的雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响及其对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的调控,探讨不同浓度雌激素对晶状体上皮细胞凋亡的作用及其机制,为合理应用雌激素防治白内障提供实验依据。方法摘取健康成年雌性SD大鼠的透明晶状体48枚,随机分为6组培养:17β-雌二醇+H2O2组1、17β-雌二醇+H2O2组2、17β-雌二醇+H2O2组3、17β-雌二醇+H2O2组4、H2O2组以及空白对照组。除空白对照组外,其他组以终浓度为300μmol.L-1过氧化氢制作晶状体上皮细胞凋亡模型,并分别加入不同终浓度17β-雌二醇干预,17β-雌二醇+H2O2组1至4的17β-雌二醇干预浓度分别为1×10-8mol.L-1、1×10-7mol.L-1、1×10-6mol.L-1、1×10-5mol.L-1。于细胞恒温培养箱中孵育24h后,撕取各组晶状体前囊及赤道部囊膜铺片,采用TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡率,免疫组织化学SP法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的阳性表达率。结果 TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡率结果显示:17β-雌二醇+H2O2各组晶状体上皮细胞凋亡率(0.4508±0.0203、0.4245±0.0196、0.4077±0.0163、0.3770±0.0205)均显著低于H2O2组(0.9048±0.0186),差异均具有显著统计学意义(均为P=0.000),并且与17β-雌二醇的浓度呈负相关。免疫组织化学SP法检测Bcl-2及Bax阳性表达率结果显示:在空白对照组晶状体上皮细胞中,Bcl-2和Bax均有表达,且Bcl-2的表达(0.8907±0.0190)远较Bax表达(0.0777±0.0234)强;H2O2可明显降低Bcl-2表达(0.0930±0.0110),提高Bax表达(0.9248±0.0238);与H2O2组比较,17β-雌二醇可明显提高Bcl-2表达(0.5662±0.0564、0.5872±0.0441、0.6212±0.0548、0.6682±0.0568),降低Bax表达(0.4677±0.0352、0.4472±0.0451、0.4077±0.0154、0.3587±0.0310),差异均有显著统计学意义(均为P=0.000)。结论 17β-雌二醇对H2O2诱导的离体培养雌性大鼠晶状体上皮细胞的凋亡有抑制作用,此抑制作用在一定范围内与17β-雌二醇的浓度呈正相关;对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的调控可能是17β-雌二醇抑制晶状体上皮细胞凋亡的分子机制之一。     

硅油并发性白内障和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中凋亡因子的表达差异

目的:分析硅油并发性白内障和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中凋亡因子的表达差异.方法:将我院2014-03/2016-03收治的硅油并发性白内障患者50例50眼作为研究组,另选同期收治年龄相关性白内障患者50例50眼作为对照组,两组患者均已如实掌握此次研究方案具体内容并签署知情同意书后对其晶状体上皮细胞中凋亡因子的表达进行测定和比较.结果:研究组Bcl-2蛋白表达阳性率92％、Bax蛋白表达阳性率100％、Caspase-3蛋白表达阳性率100％,而同期对照组Bcl-2蛋白表达阳性率80％、Bax蛋白表达阳性率84％、Caspase-3蛋白表达阳性率82％,组间差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:硅油并发性白内障晶状体上皮细胞中凋亡因子的表达显著高于年龄相关性白内障,提示晶状体上皮细胞中部分凋亡因子全程参与硅油并发性白内障的发生发展过程.     

人晶状体上皮细胞HGF与c-Met的表达对增殖和凋亡的影响

目的：探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)在人晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)的表达及其对晶状体上皮细胞的促增殖和抑制凋亡的作用。方法：取原代培养人晶状体上皮细胞，应用RT-PCR，Western blot检测HGF，C-Met的mRNA及蛋白的表达，应用MTT法检测HGF对晶状体上皮细胞增殖的影响，Western-blot检测：Bcl-2的蛋白表达，以揭示其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。结果：HGF和c-Met在人晶状体上皮细胞有表达，HGF有促进晶状体上皮细胞增殖的作用，并能抑制凋亡产生。结论：HGF参与人晶状体上皮细胞的增殖代谢过程，与晶状体上皮细胞的增殖相关。     

外源性H2S预处理对大鼠RIRI细胞凋亡的影响

目的:探讨气体信号分子硫化氢(H2S)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)过程中细胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:以硫氢化钠(NaHS)作为H2S的供体。将54只SD大鼠随机分成正常组、视网膜缺血再灌注损伤组(RIRI组)及硫氢化钠(NaHS)干预组,后两组进一步分为再灌注后6,24,48,72h组。采用前房灌注加压的方法建立RIRI模型,TUNEL法检测视网膜神经细胞凋亡,免疫组织化学法检测视网膜组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:细胞凋亡出现于缺血灌注后6h,并逐渐递增,24h达到高峰,48h开始下降。与RIRI组比,NaHS组Bcl-2蛋白表达增多,Bax蛋白表达减少(均P<0.05)。结论:H2S预处理可通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达、升高Bcl-2/Bax比值从而调控细胞凋亡,对大鼠RIRI进行保护作用。     

Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对氧化损伤诱导晶状体上皮细胞凋亡的防护作用

目的 探讨半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase-3)及其抑制剂Ac-DEVD-CHO对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响，为进一步研究晶状体氧化损伤机制及其防护提供实验依据。方法 采用大鼠离体晶状体器官培养的方法，用Western blot法分析氧化损伤后晶状体上皮细胞内caspase-3蛋白酶活性，流式细胞AnnexlnV-PI双染色法定量检测caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对晶状体上皮细胞凋亡率的影响。结果 氧化损伤诱导晶状体上皮细胞凋亡过程中，细胞内caspase-3酶活性明显增强，caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO可有效降低晶状体上皮细胞凋亡率。结论 caspase-3蛋白酶在氧化损伤诱导晶状体上皮细胞凋亡过程中占有重要地位，caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO可有效防护体外品状体上皮细胞氧化损伤。     

枸杞多糖对氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的调控

目的:研究枸杞多糖(lycium barbarum polysaccha-rides,LBP)对实验性氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞(lens ep- ithelial cell,LEC)凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的调控。方法:复制大鼠晶状体氧化损伤模型,同时加入终浓度为1g/L的枸杞多糖共同孵育24h后,取晶状体前囊膜采用免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:Bcl-2和Bax在正常SD大鼠LEC中均有表达,Bcl-2的表达远较Bax表达强。H_2O_2组Bcl-2表达显著下调,Bax表达显著上调(Ridit检验,R_1值分别为0.97和0,P<0.01,差异均有非常显著性),Bcl-2/Bax比率下降。枸杞多糖可明显上调Bcl-2表达,下调Bax的表达(与H_2O_2组比较,P值均<0.01,差异有非常显著性),Bcl-2/Bax比率上升;其改变幅度与白内停组相比差异均有显著性(P值均<0.05)。结论:氧化损伤诱导LEC凋亡和枸杞多糖抑制LEC凋亡的分子机制可能与调控凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达有关。     

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

目的:检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法:人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养,采用MTT比色法和[3H]-TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Westernblot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,c-Jun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。结果:10μg/LbFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生,1μmol/LPD98059即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖,其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/LbFGF可激活ERK信号通路,诱导COX-2蛋白表达,其效应在30min内达到高峰,6h后逐渐减弱,此作用可被10μmol/LPD98059阻断;10μg/LbFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论:有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。     

人晶状体上皮细胞成纤维细胞生长因子受体蛋白的检测(英文)

目的:研究成纤维细胞生长因子受体蛋白在人晶状体上皮细胞中的表达。方法:采用免疫组织化学方法来检测人晶状体上皮细胞bFGF受体的蛋白水平,并用图像分析进行相对定量。结果:定性及定量证明了人晶状体上皮细胞存在bFGF受体的蛋白。结论:人晶状体上皮细胞存在bFGF受体的蛋白,为bFGF促进人晶状体上皮细胞的增殖作用提供了物质基础。     

紫外线照射对SD大鼠晶状体上皮细胞p53、Bax、Bcl-2表达的影响

目的 探讨p53、Bax、Bcl-2基因在紫外线诱导晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)凋亡中的作用.方法 6周龄SD大鼠40只随机分为对照组和实验组,对照组不做处理,实验组腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(0.35 mL/100 g),以波长为300～ 320 nm的紫外线照射眼球15 min,分别于紫外线照射后1、3、5、7d处死并取出晶状体.Hoechst33258染色法观察LEC的形态变化,实时定量PCR及免疫组织化学检测p53、Bax、Bel-2mBNA和蛋白在LEC中表达水平.结果 紫外线照射后晶状体发生混浊,其LEC发生凋亡,细胞排列不规则、大小不一.实时定量PCR检测结果显示,与对照组相比,紫外线照射后1 d BaxmRNA表达水平升高(P＜0.05),照射后3、5、7 d B趿和p53 mR-NA表达水平均升高(均为P＜0.01);与对照组相比,Bcl-2 mRNA表达水平在照射后ld降低(P＜0.01),而照射后5d和7d则升高(均为P＜0.01).紫外线照射后p53与Bax mRNA相对表达水平的变化呈正相关(r=0.952,P＜0.01).免疫组织化学结果显示,紫外线照射后LEC中p3和Bax蛋白表达逐渐增强,且由细胞质向细胞核转移;相反照射后1 d Bcl-2蛋白表达降低,而3、5、7d则逐渐增高.结论 紫外线诱导LEC凋亡与p53介导Bax/Bcl-2的表达调控有关.     

银杏内酯B联合视网膜干细胞移植对青光眼大鼠的影响及机制研究

目的：研究银杏内酯B联合干细胞移植对青光眼大鼠的影响及相关机制。

方法：实验共分为五组：正常对照组(Control)、青光眼模型组(GLA)、干细胞组(RSCs)、银杏内酯B组(GKB)与混合组(RSCs+ GKB)。眼球组织进行HE染色,TUNEL染色检测视网膜神经节细胞的凋亡,免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax以及Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测各组组织中Bcl-2、Bax mRNA表达水平。

结果：HE染色结果显示,给予干细胞或银杏内酯B处理,减少纤维间质水肿与空泡的出现,混合组纤维间质少见水肿与空泡; 银杏内酯B联合干细胞处理后显著减少视网膜神经节细胞的凋亡,上调Bcl-2的蛋白与mRNA表达水平,并下调Bax的蛋白与mRNA表达水平、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达水平。

结论：银杏内酯B联合干细胞能够抑制青光眼大鼠视网膜神经节细胞的凋亡,改善青光眼,其作用机制可能与调控Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9因子的表达有关。     

Bax抑制因子1对紫外线B诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

目的　探讨Bax抑制因子1（BI-1）对紫外线B（UVB）诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。方法　取对数生长期的人晶状体上皮细胞（HLEC）系SRA01/04细胞,将BI-1过表达质粒及其空载质粒转染至SRA01/04细胞中,分别记为BI-1组、Vector组,另取不做任何处理的SRA01/04细胞作为blank组。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后各组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平。而后再根据实验需要将细胞分为6组:（1）Control组,SRA01/04细胞不经任何处理;（2）UVB组,采用紫外线（2.0 W·cm^-2）处理SRA01/04细胞60 min;（3）Vector组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞;（4）BI-1组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞;（5）Vector+UVB组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min;（6）BI-1+UVB组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min。采用实时荧光定量PCR检测UVB照射后各组细胞中BI-1 mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞中活性氧（ROS）含量,荧光探针法检测细胞内质网内Ca²⁺浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞中相关蛋白表达水平。结果　本研究中所培养的SRA01/04细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内αA-晶状体蛋白呈红色荧光。随着UVB照射强度增加,SRA01/04细胞内BI-1 mRNA表达水平逐渐降低,本研究选择UVB照射强度为2.0 W·cm^-2进行后续的实验。与blank组或Vector组相比,BI-1组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著上升,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与Control组比较,UVB组细胞增殖活性显著降低,细胞内ROS含量显著增加,细胞内质网内Ca²⁺浓度显著升高,细胞凋亡率显著升高,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著上调,Bcl-2蛋白表达水平显著下调,细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平显著上调（均为P＜0.05）。BI-1+UVB组细胞增殖活性较UVB组显著增高,细胞内ROS含量较UVB组显著降低,细胞内质网内Ca²⁺浓度较UVB组显著下降;与UVB组比较,BI-1+UVB组细胞凋亡率显著下降,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著下调,Bcl-2蛋白表达水平显著上调;BI-1+UVB组细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平较UVB组显著下调（均为P＜0.05）。结论　BI-1在UVB诱导的HLEC系SRA01/04细胞中表达显著下调,BI-1过表达可通过降低内质网内Ca²⁺浓度抑制内质网应激介导的IRE1-JNK信号通路的激活,进而抑制UVB诱导的SRA01/04细胞凋亡。     

白内障晶状体上皮细胞Bcl-2Bax表达的增龄性研究

目的 探讨随着年龄的增长白内障晶状体上皮细胞Bcl-2、Bax的基因表达与白内障发生的关系,及其在白内障发生发展中的作用机制.方法 选取行超声乳化白内障手术的患者91例91只眼,取晶状体前囊膜.根据年龄分为3组,即Ⅰ组为≤30岁的患者11例,Ⅱ组为31～60岁的患者30例,Ⅲ组为≥61岁的患者50例.采用链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法(streptavidin-peroxidase,SP)染色,镜下检测三个不同年龄组白内障患者晶状体上皮细胞Bcl-2基因蛋白与Bax基因蛋白的表达情况.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组Bcl-2基因表达分别为89%、60%、0.5%,Bax基因表达分别为0、11%、91%.各项指标经统计学分析具有统计学意义(P<0.05).结论 随着年龄的增长白内障晶状体上皮细胞Bcl-2基因表达逐渐降低,Bax基因表达逐渐增高,为在基因水平上治疗白内障提供了理论依据.

Abstract：

Objective To evaluate the relationship between cataract lens epithelial cell and Bcl-2, Bax expression with increasing age in patients, and to investigate the role of Bcl-2 and Bax expression in the occurrence and progression of human lens epithelial cells of cataract.Methods Ninety-one patients (91 eyes) who were done phacoemulsification for cataract were selected and took anterior capsule of lens.The cataract patients were divided into three groups according to age: 11 cases of less than 30 years of age in group Ⅰ , 30 cases of aged 31-60 in group Ⅱ, 50 cases more than 61 years of age in group Ⅲ.The expression of Bcl-2 and Bax in lens epithelial cells of cataract from three different age groups of cataract patient was detected by the immunohistochemical streptavidin-peroxidase (SP) method.Results The Bcl-2 gene expression in group Ⅰ , Ⅱ, and Ⅲ was 89%, 60% and 0.5% respectively, the Bax gene expression was 0, 11% and 91% respectively.The difference had the statistical significance between 3 groups (P <0.05).Conclusions The genes expression of Bcl-2 in human lens epithelial cells of cataract is gradually decreasing with age increasing, while the genes expression of Bax is gradually increasing with age increasing.It provides an important theoretical basis to treat of cataract at the gene level.     

N-乙酰-L-半胱氨酸和过氧化氢酶抑制晶状体上皮细胞凋亡及对caspase-3酶活性的影响

目的　观察抗氧化剂N 乙酰 L 半胱氨酸 (NAC)和过氧化氢酶 (catalase ,CAT)对晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用及对凋亡关键蛋白酶caspase 3酶活性的影响。方法　Sprayue Dawley(SD)大鼠 84只分成 4组 ,每组 2 1只。取晶状体于MEM培养液中培养 ,过氧化氢 (H2 O2 )组加入终浓度为 2mmol/L的H2 O2 ,对照组不加H2 O2 ,H2 O2 +NAC组及H2 O2 +CAT组除加入 2mmol/LH2 O2 外再分别加入 10 0 μmol/LNAC和 9× 10 5U/LCAT。培养 2 4h后观察晶状体透明度改变 ,透射电镜下观察细胞超微结构改变 ,流式细胞AnnexinV PI双染色法检测细胞凋亡率 ,并用Westernblot法分析caspase 3相对分子量为 2 0 0 0 0的活性亚单位的表达。结果　 2mmol/LH2 O2 作用 2 4h后可引起晶状体明显混浊 ,透射电镜下晶状体上皮细胞出现典型的凋亡形态学改变 ,细胞凋亡率上升为 (31 2± 3 3) % ,并伴随caspase 3酶活性增高 ;分别加入抗氧化剂NAC和CAT后 ,晶状体混浊度明显减轻 ,细胞凋亡率下降为(2 0 9± 3 2 ) %和 (15 0± 2 4 ) % (P <0 0 1) ,caspase 3酶活性均降低。结论NAC和CAT可有效抑制氧化损伤引起的晶状体混浊及上皮细胞凋亡 ,其抑制作用可能与降低caspase 3酶活性有关。     

血管内皮生长因子-B对高糖环境下人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的探讨血管内皮生长因子-B(vascular endothelial growth factor-B,VEGF-B)对高糖环境下诱导的人视网膜色素上皮细胞(cultured human retinal pigmentepithelial cells-19,ARPE-19)凋亡的保护作用及其机制。方法将ARPE-19细胞分为正常组(体积分数10%胎牛血清+5.6 mmol·L^-1葡萄糖)、高糖组(体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖)、药物组(100μg·L^-1 VEGF-B+体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖)、抑制组20μmol·L^-1 PD98059(ERK1/2阻滞剂)+100μg·L^-1 VEGF-B+体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖。倒置显微镜观察细胞的形态变化;CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测蛋白Bcl-2、Bax及细胞外信号调节激酶1/2(extracelluar regulated protein 1/2,ERK1/2)、p-ERK1/2表达水平;实时荧光定量PCR检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表达。结果倒置显微镜发现,高糖组细胞皱缩变小变圆,正常组及药物组细胞体积大、有突起,抑制组细胞形态及数量接近正常组,少许细胞皱缩变圆,体积变小。CCK-8法检测显示,高糖组细胞较正常组存活率降低,药物组较高糖组细胞存活率升高,抑制组细胞存活率介于高糖组和药物组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测显示,高糖组较正常组细胞正常细胞率下降、细胞凋亡率升高,药物组较高糖组正常细胞率升高、细胞凋亡率下降,抑制组细胞凋亡率介于高糖组和药物组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot和实时荧光定量PCR检测显示,高糖组较正常组Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA表达减少、Bax蛋白及Bax mRNA表达增多、Bcl-2/Bax蛋白及mRNA比值均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);药物组较高糖组Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA增多、Bax蛋白及Bax mRNA减少、Bcl-2/Bax蛋白及mRNA比值均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);高糖组p-ERK1/2表达量较正常组增多、药物组p-ERK1/2较高糖组表达增多、抑制组p-ERK1/2表达量介于药物组和高糖组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05),四组总ERK1/2表达量不变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF-B具有抑制高糖环境培养的ARPE-19细胞凋亡作用,其作用机制部分是通过ERK1/2信号通路,调节Bcl-2和Bax基因表达而实现。     

Induction of apoptosis by the calcium antagonist mibefradil correlates with depolarization of the membrane potential and decreased integrin expression in human lens epithelial cells

Background Posterior capsule opacification is still the major complication in cataract surgery and is caused by migration and proliferation of residual lens epithelial cells. The challenge of a suitable therapy to inhibit capsule opacification is to specifically interfere with cellular mechanisms. Our approach using the T-calcium channel antagonist mibefradil is based on the hypothesis that this drug inhibits the signaling pathways mediated by cell adhesion.Methods The influence of mibefradil dihydrochloride was investigated on primary human lens epithelial cells (hLEC) from cataract surgery and on the human lens cell line HLE-B3. Apoptosis was quantitatively analyzed by flow cytometry (% increase of the sub-G1 peak), and verified by confocal microscopy (annexin V-biotin, TUNEL reaction). The membrane potential was detected by a membrane potential-sensitive dye. Integrin expression and proliferation were measured by flow cytometry. T-calcium channels in hLEC were verified by the whole-cell configuration of the patch-clamp technique.Results Mibefradil induced apoptosis in hLEC. Early signs of apoptosis were observed after only 4 h of incubation with mibefradil, accompanied by a significantly reduced cell area. Apoptosis correlated with inhibited integrin expression, reduced proliferation and the depolarization of the membrane potential. We could identify calcium channels of the T-type in our primary hLEC.Conclusions We suggest that depolarization of the membrane potential and the inhibition of integrin expression leads to the loss of cell adhesion, which is the reason for the induction of apoptosis. Thus, mibefradil seems to be a suitable drug to prevent cell adhesion, migration and proliferation.