幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

狂犬病病毒浙江街毒株糖蛋白基因序列分析

目的 测定狂犬病病毒浙江株(鼬獾源和犬源)糖蛋白(GP)基因组全序列,从分子水平比较狂犬病病毒浙江株与其他地区代表性街毒株和疫苗株GP之间的差异.方法 乳鼠接种分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定狂犬病病毒浙江株GP基因核苷酸序列,并进行序列和编码蛋白的比较分析.结果测序获得浙江5株鼬獾源狂犬病病毒和9株犬源狂犬病病毒GP基因序列,全长1575个核苷酸,编码524个氨基酸.浙江病毒株与其他地区街毒株、疫苗株核苷酸和氨基酸序列相似性在82.3%～99.9%和85.1%～99.8%之间,种系分析显示浙汀株均为基因1型,GP编码蛋白无重组,主要抗原位点未出现较大的变异.结论 对GP基因一级结构综合分析表明,在某些区域存在优势抗原表位的可能性较大,可能出现潜在的蛋白质抗原决定簇,浙江株GP基因变异较小,与国内其他地区流行的代表性街毒株相似,但高于其他疫苗株,在基因结构及种系进化关系上存在一定的距离.     

4种血清型登革病毒NS1蛋白序列及B细胞抗原表位特异性分析

目的比较4种血清型登革病毒NS1蛋白型特异性抗原表位基因序列及氨基酸序列之间的差异,为利用基因差异进行血清学分型及疫苗研究提供新的线索。方法利用DNAstar数据包中的Editseq程序,从20株登革病毒分离株的全基因组序列中将NS1基因型特异性抗原表位序列截取出来,再用ClustalX软件进行多序列比对,进行同源性分析,找出型内最为保守的抗原表位序列。并将比对结果在120株登革病毒序列中进一步验证。结果 NS1蛋白36～45和71～85位氨基酸为型特异性抗原表位,高度保守,型内完全相同,型间不同。结论 NS1蛋白36～45位氨基酸可以作为登革病毒血清分型和研制亚单位疫苗的靶标。     

2010-2012年长沙市流感流行情况及B型流感病毒基因特性分析

目的分析2010-2012年长沙市流感流行情况,并探讨B型流感病毒分离株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的分子流行病学特征。方法采集长沙市流感网络监测哨点医院及暴发点流感样病例(ILI)咽拭子样本,狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离,血凝和血凝抑制实验进行型别和亚型鉴定;提取B型流感病毒核酸,一步法RT-PCR扩增HA和NA基因片段,双向测定扩增产物核苷酸序列,对基因序列和氨基酸序列进行分析。结果 2010-2012年间,长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,流行高峰为冬春季。3年间共分离到B型流感病毒78株,其中79.5%为Victoria系,20.5%为Yamagata系,以Victoria系为主。与WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,HA基因的同源性在87.2%~98.4%之间,NA基因的同源性在94.5%~97.5%之间。氨基酸序列分析发现,与疫苗株相比,HA蛋白主要存在单个氨基酸的突变;种系进化分析发现,所有毒株HA和NA蛋白位于相应的谱系内,无抗原重排发生。结论 2010-2012年间长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,B型流感病毒HA基因出现抗原漂移,但无重组毒株的出现。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

2016年6月至2017年4月辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析

目的 本文对2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因遗传进化特征分析。方法 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对选取的4株H7N9禽流感病毒株HA和NA基因进行扩增并测序,用生物信息学软件分析其基因进化变异特征。结果 2016年6月至2017年4月辽宁省4株毒株的HA和NA基因与WHO最新推荐的A/Hunan/02650/2016疫苗株的同源性最高,其HA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为99.3%~99.6%,99.8%~100%;NA基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为97.7%~99.7%;98.3%~99.6%。本省所有毒株均属长江三角洲谱系,但主要聚集在两个次分支。4株病毒HA蛋白裂解位点333-342氨基酸序列均为PEIPKGR↓GLF,在338-339位点无连续的多个氨基酸插入(KRTA),属于低致病性禽流感病毒分子特征。HA受体结合位点均出现S138A、G186V、Q226L、T221P氨基酸的突变,NA茎部区均出现“QISNT”缺失,且NA蛋白上相关耐药位点上的氨基酸并未发生突变,3株毒株NA蛋白上糖基化位点第42位发生氨基酸序列NCSH→NCTH突变。结论 2016-2017年辽宁省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因关键位点氨基酸发生突变,使病毒具有双受体结合特性以及毒力增强。     

丙型肝炎病毒MHC-Ⅱ类抗原表位预测

目的预测各型丙型肝炎病毒(HCV)的MHC-Ⅱ类抗原表位,为HCV的疫苗研发提供理论依据。方法从NCBI数据库中检索出10条包含6种基因型的HCV完整氨基酸序列,使用在线MHC-Ⅱ类抗原表位分析工具NetMHCⅡpan-2.1 Server,从MHC-Ⅱ类抗原表位在6种HCV型别之间的保守性及与MHC-Ⅱ类分子亲和力两方面评价HCV携带的潜在MHC-Ⅱ类抗原表位。结果位于NS3和NS5B蛋白的3段表位核心序列具有较好的保守性,其中尤以NS3蛋白携带的表位核心序列保守性最好;高亲和力的MHC-Ⅱ类抗原表位主要位于E2、NS5A、NS4A和NS5B蛋白,其中E2和NS5A蛋白携带的高亲和力抗原表位较为丰富。结论 NS5B蛋白所携带的MHC-Ⅱ类抗原表位兼顾了各个HCV基因型之间的保守性及与MHC-Ⅱ类分子的高亲和力,具有较好的疫苗应用前景;NS3、E2、NS5A和NS4A蛋白有可能成为HCV多表位肽疫苗的备选组分。     

幽门螺杆菌ureA、ureB基因克隆、序列分析及在E.coli中的表达

目的：构建含幽门螺杆菌（Hp）ureA、ureB基因重组质粒，测定、分析其核酸序列及推定的氨基酸序列，在E.coli中高效表达两基因，为检测试剂和疫苗研究提供基础依据和抗原。方法：PCR法扩增Hp菌株HPSH4的ureA、ureB基因，分别与pGEX-2T载体连接并转化大肠杆菌JM105，测定克隆基因的核酸序列并与GenBank公布的国外5株Hp菌株（26695，HPK5，J99，CPM630，M60398）的ureA、ureB基因作序列比较，以IPTG诱导，ureA、ureB基因在E.coli中高效表达。结果：ureA核酸同源性96.3％-98.1％，氨基酸同源性98.3％-100％；ureB核酸同源性95.8％-98.0％，氨基酸同源性96.4％-99.6％。以IPTG诱导，在E.coli中表达rureA融合蛋白55600D，rureB融合蛋白85500D。结论：不同地区Hp菌株的ureA、ureB存在程度不同的变异，克隆并表达HPSH4的ureA、ureB与GenBank已公布的多数Hp菌株有极高同源性，在E.coli以融合蛋白高效表达rureA和rureB。     

戊型肝炎病毒基因Ⅳ型病毒样颗粒的表达和抗原性分析

目的表达戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅳ型(G4)结构蛋白ORF2截短的基因片段,观察病毒样颗粒(VLP)的装配情况,对纯化的VLP进行抗原性分析。方法为了制备HEV病毒样颗粒,将结构蛋白ORF2的N末端111个氨基酸残基截掉,然后将112至660共549个氨基酸残基的基因与杆状病毒基因重组,在昆虫细胞Tn5表达。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳和WesternBlotting检测基因是否正确表达,再用超速离心检测是否形成病毒样颗粒,最后用免疫电镜和ELISA分析病毒样颗粒的抗原特异性。结果含有截掉了N末端111个氨基酸残基的HEVG4的ORF2基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞Tn5,除了可以表达最初的产物(相对分子质量为58×103的蛋白分子)外,也产生了一些可能经过宿主细胞酶类处理的蛋白分子,相对分子质量分别为57×103、56×103和54×103,并分泌到培养液中。经超速离心和密度梯度离心,电镜观察发现只有54×103的蛋白分子可以自行组装成VLP,颗粒直径为23~24nm,浮密度为1·285g/cm3,与HEVG1比较,G4VLP具有相同的大小和浮密度,但表达量低。G4VLP与HEV病人血清可以发生抗原抗体反应,用G4VLP作抗原可以检测HEV的G1、G3、G4型特异性IgM和IgG抗体。结论该研究证实截短的HEVG4的ORF2结构蛋白基因可以在重组杆状病毒表达系统高效表达。形成的VLP具有HEV病毒颗粒类似的抗原活性,可用于制备抗HEV诊断试剂和开发预防用疫苗。     

中国W群脑膜炎奈瑟菌分子流行病学特征北大核心

目的分析中国W群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)的分子流行病学特征。方法选择1979-2018年分离于中国19个省份的流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例和健康携带者W群Nm菌株,进行多位点序列分型(MLST),分析序列型(ST型)并构建最小生成树,以及分析部分菌株疫苗相关蛋白PorA(114株)、FHbp(93株)、NadA(52株)和NHBA(51株)的分子型别和序列特征。结果共获得246株W群Nm,其中流脑病例19株、健康携带者227株。所有菌株分为24种ST型,其中20种(240株)可归入5个已知克隆群—CC11、CC4821、CC174、CC175和CC5,4种(6株)不能归入任何克隆群。健康携带者Nm菌株的克隆群2004年前主要为CC174(7株),2005年后主要为CC11(121株)和CC4821(73株)。流脑病例Nm菌株的PorA型主要为P1.5,2(16株)、P1.5-3,10-2(1株)。93条完整的FHbp蛋白氨基酸序列分为变异2型(91株)、变异1型(1株)和变异3型(1株)。52株检测菌株中32株含有nadA基因,其中30株属于CC11,均为NadA-2/3型。51条NHBA氨基酸序列包括6种型别,主要为29型(28株)和697型(18株)。结论2005年后中国W群Nm主要流行克隆群发生变化,以CC11和CC4821为主且其疫苗相关蛋白多态性较强;应更有针对性地研发疫苗或开展通用疫苗研究。     

Predicting antigenic variants of influenza A/H3N2 viruses

Current inactivated influenza vaccines provide protection when vaccine antigens and circulating viruses share a high degree of similarity in hemagglutinin protein. Five antigenic sites in the hemagglutinin protein have been proposed, and 131 amino acid positions have been identified in the five antigenic sites. In addition, 20, 18, and 32 amino acid positions in the hemagglutinin protein have been identified as mouse monoclonal antibody-binding sites, positively selected codons, and substantially diverse codons, respectively. We investigated these amino acid positions for predicting antigenic variants of influenza A/H3N2 viruses in ferrets. Results indicate that the model based on the number of amino acid changes in the five antigenic sites is best for predicting antigenic variants (agreement = 83%). The methods described in this study could be applied to predict vaccine-induced cross-reactive antibody responses in humans, which may further improve the selection of vaccine strains.     

北半球季节性甲型流感疫苗株HA抗原表位的分析

摘要:目的　分析近20年北半球甲型流感疫苗株血凝素（Hemagglutinin,HA）抗原的氨基酸和N-糖基化位点变异情况。方法　利用生物信息学软件分析1990-2012年季节性流感疫苗株H1N1的4个抗原决定簇Sa、Sb、Ca、Cb和H3N2的4个抗原决定簇A、B、C、D的氨基酸和N-糖基化位点变异情况。结果　（1）H1N1疫苗株Sb抗原决定簇28、40位氨基酸N-糖基化位点相对保守,而142位氨基酸发生改变。（2）Sb抗原决定簇上无N-糖基化位点。（3）H3N2疫苗株B、D抗原决定簇2、479、181、301位氨基酸N-糖基化位点相对保守,而149位氨基酸发生改变。（4）H3N2疫苗株的N-糖基化位点不在抗原位点上。结论　（1）流感疫苗株HA抗原氨基酸变异集中在HA1蛋白环状部位。（2）流感疫苗株的N-糖基化位点在相对保守的序列,并且相同亚型的流感疫苗株有相似的N-糖基化位点。（3）HA蛋白变异可以推测流感病毒基因的改变,为选择与之匹配的流行株提供参考。     

Variability of hemagglutinin-neuraminidase and nucleocapsid protein of vaccine and wild-type mumps virus strains.

The mumps virus (MuV) molecular evolution is characterized by the co-circulation of numerous distinct strains. Standardized phylogenetic analyses based on the nucleotide sequences of the SH gene are important for mumps surveillance, but lack the information regarding antigenic properties. So far, the location of antigenic epitopes has been determined for two MuV proteins, the hemagglutinin-neuraminidase (HN) and the nucleocapsid (N) protein. We performed multiple sequence comparisons of putative HN and N protein sequences in order to describe their diversity and plasticity, and to determine the level of similarity between vaccine and wild-type strains. The results of full-length HN or N protein phylogeny showed that MuV strains form a number of differing clades which are in concordance with grouping obtained by standard MuV genotyping. When vaccine strains are compared to all wild-type strains, the highest mean percentage of amino acid differences in both HN and N protein analysis was found for Jeryl Lynn 5 and Jeryl Lynn 2 strains while the lowest value was obtained for Leningrad-3 and L-Zagreb strains. When only 3 antigenic regions of the HN protein, comprising 45 amino acids in total, were investigated, the diversity is considerably diminished: 51.5% of all putative HN proteins show identical sequences (including those of vaccine strains L-Zagreb, Leningrad-3, Hoshino and Urabe). Another 26.5% proteins (including Miyahara vaccine strain) differ in only one amino acid, while the others differ in two to five amino acids from the most common sequence. Jeryl Lynn 2 and Jeryl Lynn 5 strains differ in four amino acids each. N protein antigenic sites have been mapped within its hypervariable C-terminus. Our results indicate that there might be genotype-specific amino acids residing in this antigenic region. The results of our study present the background information for investigations of MuV heterogeneity and antigenic diversity.     

Production of mouse monoclonal antibodies against Helicobacter pylori Catalase and mapping the antigenic epitope by phage display library

The Catalase of Helicobacter pylori (H. pylori) helps bacteria to protect themselves from oxygen toxicity and damage and have been identified an immunodominant antigen. To obtain mouse monoclonal antibodies (mAbs) against Catalase and to map its antigenic epitope is potentially to develop a vaccine for prevention and treatment of H. pylori infection. In our study, MAbs were produced by the hybridoma technique using recombinant Catalase--GST as the immunogen and were immunoscreened against phage-displayed random dodecapeptide library (Ph.D.-12). After three rounds of biopanning, 34 phage clones were randomly selected and their specificity to mAb was verified by sandwich and competitive inhibition ELISA. Fifteen phage clones were sequenced and their amino acids were deduced. One mimotope (SVSLPYANLATH) showed good match with Catalase protein at 394-405aa and the serum of mice induced by the phage clone clearly recognized Catalase protein. Our work suggests that the antigenic epitope could be mapped through screening the phage-displayed peptide libraries with mAb and a mimotope of Catalase would provide an alternative approach for the development of a vaccine for H. pylori.     

Serum-derived IgG1-mediated immune exclusion as a mechanism of protection against H. pylori infection

The induction of protective immunity against Helicobacter challenge in a murine model was found to correlate with the magnitude of IgG (serum and gastric lavage) responsiveness to intra-nasal (i.n.) immunisation. IgG1-secreting hybridoma backpacks in Helicobacter pylori (H. pylori)-infected mice revealed serum transudation into the stomach. A Lpp20-specific monoclonal antibody was associated with significantly reduced H. pylori colonisation. Histology revealed aggregates of the remaining H. pylori in these mice, suggesting a role for IgG1-mediated immune exclusion of the bacteria. In vitro immunogold electron microscopy supported this hypothesis, but also suggested that a threshold of H. pylori-specific antibody needs to be maintained if immune exclusion by the host is to overcome immune evasion by the bacteria.     

P22 VLPs载体多表位幽门螺杆菌疫苗的构建及表征分析

目的 利用生物信息学软件分析幽门螺杆菌主要抗原蛋白的T/B淋巴细胞表位,评估不同表位组合的抗原性与致敏性,预测优势表位组合与P22噬菌体病毒样颗粒（ VLPs）融合后的三级结构,构建基于P22 VLPs的多表位幽门螺杆菌疫苗。方法 利用IEDB数据库、NetMHCIIpan-3.2 和BepiPred 2.0在线工具对抗原蛋白的T/B淋巴细胞表位进行搜索和预测;利用VaxiJen v2.0、AllerTOP v2.0和ProtParam在线服务器分别对随机串联组成的不同表位组合进行抗原性、致敏性和理化性质进行分析;采用AlphaFold2、ProSA-web、RAMPAGE及ERRAT等软件对融合蛋白的三级结构进行预测、评估;构建P22 VLPs载体多表位幽门螺杆菌疫苗P22-C3,通过诱导表达及纯化获得疫苗实体;运用SDS-PAGE、透射电子显微镜和动态光散射技术对疫苗实体进行表征分析。结果 将筛选得到的高保守、非致敏优势抗原表位进行随机串联,获得了20个表位组合（C1-C20）,这20个表位组合均具有良好的抗原性和非致敏性。其中,表位组合C3不仅抗原评分高、理化性质稳定且预测的结构模型符合天然构象。将C3序列融合至P22 VLPs衣壳蛋白（Gp5）的C端,获得了基于P22 VLPs的幽门螺杆菌疫苗P22-C3。表征分析显示P22-C3较野生型的P22 VLPs,衣壳更厚,直径更大。结论 本研究通过多维生物信息学软件分析了不同Hp表位组合的理化特性和三维结构,成功构建了基于P22 VLPs的幽门螺杆菌疫苗,为疫苗后期的动物试验和I期临床试验奠定了基础。     

Influenza hemagglutinin antigenic distance measures capture trends in HAI differences and infection outcomes,but are not suitable predictive tools

Vaccination is the most effective method to combat influenza. Vaccine effectiveness is influenced by the antigenic distance between the vaccine strain and the actual circulating virus. Amino acid sequence based methods of quantifying the antigenic distance were designed to predict influenza vaccine effectiveness in humans. The use of these antigenic distance measures has been proposed as an additive method for seasonal vaccine selection. In this report, several antigenic distance measures were evaluated as predictors of hemagglutination inhibition titer differences and clinical outcomes following influenza vaccination or infection in mice or ferrets. The antigenic distance measures described the increasing trend in the change of HAI titer, lung viral titer and percent weight loss in mice and ferrets. However, the variability of outcome variables produced wide prediction intervals for any given antigenic distance value. The amino acid substitution based antigenic distance measures were no better predictors of viral load and weight loss than HAI titer differences, the current predictive measure of immunological correlate of protection for clinical signs after challenge.     

2000—2007年佛山市甲1亚型（H1N1）流感病毒监测情况及其HA1基因的变异

目的分析2000—2007年佛山市甲1亚型（H1N1）毒株流行情况及其HA1基因变异情况。方法用MDCK细胞分离流感病毒,采用血球凝集抑制试验进行型别鉴定,选取每年2～4株甲1亚型毒株的细胞培养物提取病毒核酸,进行HA1基因的逆转录,对其核苷酸和氨基酸序列及亲缘关系进行分析。结果病毒分离结果显示2000—2007年间甲1亚型流感病毒在佛山市人群中的流行是间断性的,只在2000、2001、2005、2006年4个年份分离到甲1亚型流感毒株。毒株的HAl区氨基酸序列与流感疫苗推荐株A／NewCMedonia／20／99和A／Solomon Islands／3／2006相比,同源性分别为97．2％～99．7％和97．2％-98．5％。氨基酸残基平均替换数随年份的推移而增加,只有2006年的毒株在抗原决定簇发生了替换。结论与疫苗株比较,佛山市的甲1亚型流感毒株抗原性已逐渐发生了改变,应密切注意疫苗对毒株的免疫效果。