糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤变化及Cyt C和Caspase-3的表达

目的探索高血糖状态下，急性心肌缺血诱导心肌细胞凋亡的程度变化及其可能机制。方法TUNEL法检测糖尿病大鼠IRI心肌细胞凋亡的程度，应用免疫组化染色技术检测大鼠心肌细胞色素C（Cyt C）和Caspase-3的表达。结果随心肌缺血再灌注时间的延长，糖尿病（DM）组AI呈逐渐上升的趋势，非糖尿病（NDM）组AI呈先上升再下降的趋势；缺血30min后再灌，6h内DM组大鼠Cyt C和Caspase-3的阳性表达率或阳性强度均明显低于NDM组；24h时DM组大鼠Cyt C和Caspase-3的阳性表达率或阳性强度均明显高于NDM组；Cyt C和Caspase-3的表达与AI值呈正相关。结论DM组大鼠心肌IR后24h内，心肌细胞Cyt C和Caspase-3阳性表达增加发生延迟，持续时间长；相同时相，糖尿病大鼠心肌IRI细胞凋亡较非糖尿病大鼠减轻的可能机制为细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经发生耐受。     

内皮抑素对异位子宫内膜细胞的作用及机制

目的探讨内皮抑素诱导人异位子宫内膜细胞凋亡的效果及作用机制。方法选取2014年2-12月湖北省人民医院妇产科收治的子宫内膜异位症患者共18例,收集异位子宫内膜标本进行原代分离和培养,分别用10、50和100μmol/L的内皮抑素处理作为实验组,等体积磷酸盐缓冲液(PBS)处理作为对照组。采用流氏细胞术检测细胞凋亡率及线粒体跨膜电位的变化;采用蛋白印记技术检测细胞色素C及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、Caspase-8、Caspase-9的表达水平。结果内皮抑素体外能够诱导人腺上皮细胞和间质细胞发生凋亡,且呈明显的药物浓度依赖性,100μmol/L的内皮抑素作用48 h后,凋亡率分别为24.89%及29.23%。内皮抑素诱导胞质中细胞色素C、Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8表达上调,线粒体跨膜电位崩溃。结论内皮抑素能诱导异位子宫内膜细胞发生凋亡,其机制可能与上调细胞色素C基因的表达,激活前体Caspase-9(Pro Caspase-9)、Pro Caspase-3、Pro Caspase-8,最终经线粒体信号转导途径诱导细胞凋亡有关。     

氟对大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的：探讨氟对肾脏细胞凋亡的影响。方法：给wistar大鼠饮用含50mg/L氟化钠的高氟水,6个月后,用TUNEL法和流式细胞术检测大鼠肾脏细胞凋亡。结果：氟能诱导大鼠肾脏TUNEL阳性细胞,而且凋亡细胞率较对照组明显增高,结论：研究提示氟可诱导大鼠肾脏细胞凋亡。     

二硫化碳对大鼠睾丸组织细胞凋亡线粒体通路的影响及环孢素A的干预作用

[目的]研究二硫化碳(carbon disulfide,CS2)对大鼠睾丸生殖细胞凋亡线粒体通路的影响及其可能的分子机制,同时观察环孢素A(cyclosporin A,Cs A)对细胞凋亡的干预作用。[方法]选取清洁级雄性SD大鼠48只并随机分为6组:对照组、3个CS2染毒组(50、250、1 250 mg/m3)、干预组[CS2(1 250 mg/m3)+Cs A(12.5 mg/kg)]和Cs A(12.5 mg/kg)组。静式吸入染毒,每天2 h,每周5 d,共10周,对照组仅吸入新鲜空气,Cs A则依据大鼠体重并按相应比例先溶解在牛奶中然后灌胃。染毒结束后取睾丸组织做HE染色,观察其形态学改变;TUNEL荧光法检测大鼠睾丸组织细胞凋亡情况;Western Blot法检测各组细胞色素C(Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸酶原9(Procaspase-9)、Procaspase-3、Bcl-x L抗凋亡和促凋亡蛋白Bad的表达含量。[结果]随着CS2染毒浓度的增加,HE染色大鼠睾丸组织形态损伤情况不断加剧,中、高浓度组的凋亡指数高于对照组(P<0.05),Cs A干预对大鼠睾丸组织形态损伤有一定缓解;与高浓度CS2染毒组相比,干预组的凋亡指数明显下降(P<0.05),但仍高于Cs A组(P<0.05)。CS2染毒组Cyt C、Bad蛋白含量与对照组比较有所增加,而Procaspase-9、Procaspase-3和Bcl-x L蛋白含量则有下降的趋势(P<0.05)。Cs A干预后与高浓度CS2染毒组比较,干预组Cyt C蛋白含量下降(P<0.05),Bcl-x L蛋白含量则提高(P<0.05);Procaspase-9、Procaspase-3和Bad蛋白含量均有不同程度的变化,但与CS2高浓度组相比差异无统计学意义。[结论]CS2染毒可影响细胞凋亡线粒体通路继而诱导大鼠睾丸生殖细胞凋亡,而细胞凋亡线粒体通路相关蛋白的表达可能与Cs A的干预有关。     

苯并(a)芘致神经元线粒体膜电位和胞质细胞色素C的变化

目的 探讨苯并(a)芘[B(a)P]致神经元凋亡中线粒体膜电位和胞质中细胞色素C(CytC)蛋白变化.方法 选用新生1～3 d的SD大鼠分离大脑皮质进行神经元培养,在细胞培养第5天,选取生长良好的同批次神经细胞,以B(a)P同时加S9分别对神经元染毒,使B(a)P终浓度分别为0、10、20、40 μmol/L.继续培养40 h,应用Annexin V和碘丙啶(PI)双染法进行细胞凋亡的检测,加入Rh123,应用流式细胞仪测定细胞线粒体膜电位,免疫印迹(Western blot)法测定神经元胞质中Cyt C蛋白的表达.结果 随着B(a)P浓度的增加,神经细胞的早期、晚期凋亡率逐渐增高,中、高剂量组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),趋势检验表明,早期凋亡率增高具有剂量依赖性.随B(a)P染毒浓度的增加,神经细胞线粒体膜电位下降,低、中、高剂量组神经细胞膜电位分别为5.02±1.32、4.36±1.26、3.15±1.47,与对照组(8.89±2.18)比较,差异均有统计学意义(P<0.05),线粒体膜电位与早期凋亡率之间呈负相关(r=-0.763,P<0.05);随着B(a)P浓度的增加,胞质中Cyt C蛋白的表达逐渐升高,Cyt C蛋白表达与早期凋亡率间呈正相关(r=0.831,P<0.01).结论 B(a)P可致神经细胞凋亡,线粒体膜电位降低以及Cyt C的释放可能是诱发凋亡的主要因素.     

高碘致发育期大鼠学习记忆能力及海马神经组织凋亡的影响

目的探讨饮用水高碘对大鼠学习能力及海马神经组织凋亡功能的影响。方法将24只SPF级成年SD孕鼠随机分为4组,分别为对照组(饮用自来水)及500、2 500、5 000μg/L碘酸钾暴露组,采用自由饮水方式进行高碘暴露,连续暴露21 d。随机从各剂量组选择断乳雌、雄仔鼠各10只,延用相同剂量进行暴露直至第4个月末。应用Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力,采用RT-PCR法检测大鼠海马组织Bcl-2、Caspase-3和Cyt C mRNA的表达水平,采用Western Blot法检测大鼠海马神经组织Bcl-2、Caspase-3和Cyt C蛋白的表达水平。结果与对照组相比,5 000μg/L碘酸钾暴露组雄性大鼠训练不同时间内的平台潜伏期均延长,而2 500μg/L碘酸钾暴露组雌性大鼠仅训练第2天时的平台潜伏期延长,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,各浓度碘酸钾暴露组大鼠穿越平台的次数均下降,差异有统计学意义(P0.05);而空间探索时间、路径比例均无明显变化。随着碘酸钾暴露浓度的升高,雄性大鼠穿越平台次数呈下降趋势。与对照组相比,2 500μg/L碘酸钾暴露组大鼠海马神经细胞Caspase-3基因表达水平升高,差异有统计学意义(P0.05);而各浓度碘酸钾暴露组大鼠海马神经细胞Bcl-2、Cyt C基因的表达水平均无明显改变。与对照组相比,2 500、5 000μg/L碘酸钾暴露组大鼠海马神经细胞Cyt C和Caspase-3蛋白的表达水平均升高,Bcl-2蛋白的表达水平均降低,差异有统计学意义(P0.05);与500μg/L碘酸钾暴露组相比,5 000μg/L碘酸钾暴露组雄性大鼠海马神经细胞Cyt C和Caspase-3蛋白的表达水平升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论高碘暴露可造成4月龄大鼠空间学习和记忆能力的下降,可能与海马神经细胞发生凋亡有关。     

镍冶炼烟尘对大鼠肺细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

目的探讨镍冶炼烟尘对大鼠肺组织细胞凋亡相关蛋白p-JNK、Bax、Caspase-9和Caspase-3表达水平的影响。方法健康Wistar雄性大鼠40只,随机分为5组:对照组及镍冶炼烟尘0.50、1.00、2.00、4.00 mg/kg组,第1天及第16天非暴露式气管内滴注受试尘,30 d处死。Hoechst33258法观察肺内细胞形态学改变;分光光度法测定肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的含量;免疫印迹(Western blot)法检测肺细胞p-JNK、Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平。结果与对照组比较,各染毒组大鼠肺组织细胞凋亡率均增高,差异有统计学意义(P0.05);4.00 mg/kg染毒组细胞出现胞核固缩碎裂等凋亡早期形态学特征;各染毒组大鼠肺组织中SOD、GSH-Px活力较对照组显著降低,MDA含量显著升高,差异有统计学意义(P0.05);染毒组大鼠肺组织Bax蛋白表达均高于对照组(P0.05),肺组织p-JNK、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。结论镍冶炼烟尘引起大鼠肺组织氧化损伤,同时促进p-JNK、Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达,最终产生凋亡。     

高脂饮食肥胖大鼠胰岛细胞凋亡与Mcl-1表达及意义

目的 通过建立高脂饮食诱导肥胖大鼠模型,研究肥胖大鼠胰岛细胞中线粒体途径抗凋亡蛋白髓样细胞白血病因子-1(Mcl-1)表达情况及其与β细胞凋亡的相关性,探究肥胖大鼠胰岛细胞损伤可能的机制。方法 SPF级3周龄雄性SD大鼠72只,随机分为普通饲料组和高脂饲料组 。在高脂喂养8、16、20、24周末筛选出符合肥胖标准的大鼠设为肥胖组,普通饲料组设为对照组。ELISA检测血清,游离脂肪酸(FFA)水平, 通过透射电镜观察胰岛β细胞微观结构改变,免疫组化SP法检测胰岛组织中Mcl-1蛋白的表达情况,并通过Real-Time PCR检测胰腺组织中Mcl-1的mRNA表达水平,原位末端标记法(TUNEL法)检测两组大鼠的胰岛细胞凋亡率。结果 1)高脂喂养20周,肥胖组大鼠血清FFA水平显著高于对照组(P<0.01);2)电镜结果显示,16周末肥胖组大鼠胰岛β细胞结构与对照组相比,出现凋亡样改变,且随时间推移有所加重;3)高脂喂养20周,肥胖组大鼠抗凋亡相关蛋白Mcl-1表达较对照组明显降低(P<0.05);4)RT-PCR结果显示, 高脂喂养16周,抗凋亡相关蛋白Mcl-1的mRNA水平明显降低(P<0.05);5)高脂喂养20周,与对照组大鼠相比,肥胖组凋亡率显著增加(P<0.01);6)大鼠胰岛细胞凋亡率与血清FFA水平呈正相关(r＝0.536,P<0.01),与Mcl-1基因的表达水平呈负相关(r＝-0.776,P<0.01)。结论 高脂饮食肥胖大鼠胰岛β细胞形态结构异常, 线粒体途径抗凋亡蛋白Mcl-1表达降低,胰岛细胞凋亡率与Mcl-1表达呈负相关。提示肥胖大鼠存在胰岛β细胞损伤,其机制与线粒体凋亡途径有关。     

乙苯对大鼠尿中苯乙醇酸、苯乙醛酸水平、肾组织超微结构及线粒体凋亡相关蛋白表达的影响

目的 探讨亚慢性染毒乙苯对大鼠尿中苯乙醇酸、苯乙醛酸和肾组织超微结构及线粒体凋亡相关蛋白表达的影响.方法 SD大鼠雄性40只,随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只,分别染毒0、433.5、4335.0和6500.0 mg/m~3的乙苯,每天6 h,每周5 d,共13周,建立大鼠乙苯亚慢性染毒模型;高效液相色谱法测定染毒后大鼠尿中苯乙醇酸(MA)和苯乙醛酸(PGA)水平,电镜观察肾组织的超微结构,Western blot法检测肾组织B细胞淋巴瘤-2相关联X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、细胞色素C(cytochromeC,Cytc)、细胞凋亡蛋白酶(Caspase-3)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)等线粒体凋亡相关蛋白的表达.结果 中、高剂量组大鼠尿中MA[(0.303±0.148)、(0.404±0.154)mg/L]和PGA[(0.168±0.104)、(0.174±0.092)mg/L]水平均明显高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),且MA、PGA均与乙苯外暴露剂鼍呈现一定的剂量-效应关系(r=0.827,r=0.720,P<0.05).高剂量组大鼠肾组织线粒体普遍肿胀,呈空泡状,部分线粒体嵴排列紊乱,线粒体嵴消失.中、高剂量组大鼠肾组织Bax表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各剂苗组大鼠肾组织Cytc和Caspase-9表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中、高剂量组大鼠肾组织Caspase-3表达水平均明显高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,各剂量组大鼠肾组织Bcl-2表达水平均明显下降差异有统计学意义(P<0.05).结论 乙苯致大鼠肾组织细胞线粒体损伤可能是乙苯细胞毒作用机制之一,其机制可能与线粒体凋亡相关蛋白表达有关,大鼠尿中苯乙醇酸和苯乙醛酸可作为乙苯暴露后生物内剂量指标.     

黄芪多糖联合5-氟尿嘧啶对骨肉瘤细胞系MG63细胞中CD133~+细胞凋亡影响及其分子机制

目的探索黄芪多糖联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对骨肉瘤细胞系MG63细胞中CD133~+细胞凋亡的影响及分子机制。方法免疫磁珠分选MG63细胞中CD133~+细胞; MTT实验检测黄芪多糖、5-FU以及联合使用对CD133~+细胞增殖的影响;线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞中线粒体膜电位; q PCR实验检测细胞中Bax、Bcl-2 mRNA表达;Western blot实验检测细胞中Cyt C、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达;体内观察干预后CD133~+移植瘤的生长; Western blot实验检测移植瘤中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达。结果磁珠分选富集的CD133~+细胞,纯度达到90%。经干预后发现与单独使用相比,联合使用对CD133~+细胞和CD133~+细胞移植瘤增殖生长具有更强的抑制,线粒体膜电位显著降低,同时诱导CD133~+细胞中Bax mRNA、Cyt C蛋白以及体内外细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著升高,显著抑制Bcl-2 mRNA表达。结论与单独干预相比,黄芪多糖联合5-FU可显著诱导MG63细胞中CD133~+细胞及其移植瘤凋亡,其分子机制可能与线粒体凋亡相关。