顺铂诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制的研究

目的:研究顺铂在体外诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制。方法:采用MTT法测定顺铂对Hela细胞增殖的影响;流式细胞仪和Hochest33258检测药物作用前后的细胞凋亡情况;RT-PCR检测HPVE6的mRNA水平表达;WesternBlot测定HPVE6、p53、p21、Bax、Bcl-2蛋白水平的表达。结果:顺铂抑制Hela细胞生长呈时效和量效关系;经10μg/ml顺铂分别在12、24、36、48小时作用Hela细胞,亚G1峰与对照组有显著性差异;RT-PCR提示顺铂作用Hela细胞后HPVE6的mRNA水平表达逐渐降低;WesternBlot提示顺铂作用Hela细胞后HPVE6的蛋白水平表达逐渐降低,p53、p21和Bax蛋白水平表达逐步升高,Bcl-2的表达无变化。结论:顺铂通过抑制HPVE6的表达,恢复p53的功能,引起细胞凋亡,起到杀伤肿瘤的作用。     

NDRG2 siRNA对宫颈癌Hela细胞顺铂化疗敏感性影响的研究

目的：探讨人源N-myc下游调节基因2（N-Myc downstream-regulated gene 2,NDRG2）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对宫颈癌Hela细胞的化疗增敏作用。方法：利用化学合成的针对NDRG2特异性siRNA借助脂质体转染宫颈癌Hela细胞。采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测NDRG2mRNA和蛋白在宫颈癌Hela细胞的表达情况。通过MTT法检测该细胞在顺铂作用下的体外存活率。结果：化学合成的NDRG2特异性siRNA oligomer可使Hela细胞的NDRG2表达水平明显降低,增强了顺铂对Hela细胞体外生存的抑制能力。转染Negative-control oligomer的Hela细胞与转染NDRG2siRNA oligomer HSS126269的Hela细胞相比,其存活情况出现明显差异,IC50值分别为（6.69±0.33）和（1.69±0.25）μg/L,差异有统计学意义,t=17.311,P=0.003。结论：抑制NDRG2表达可以提高宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性,具有一定的临床应用前景。     

雷帕霉素联合顺铂对宫颈癌Hela细胞生长和对HIF-1α与VEGF表达影响的观察

目的:探讨mTOR抑制剂雷帕霉素与顺铂联合应用对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF-1α和VEGF表达的影响。方法:分别以雷帕霉素、顺铂及雷帕霉素联合顺铂处理体外培养人宫颈癌Hela细胞,采用MTT比色法检测人宫颈癌Hela细胞的抑制率,金氏公式评价两药联合用药的效果,采用RT-PCR法、蛋白质印迹法检测各组细胞HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表达。结果:雷帕霉素和顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性,分别联合应用2种浓度雷帕霉素(10和20nmol/mL)与顺铂(0.25和0.5mg/mL)协同治疗指数q值均>1.15,两者有协同作用。雷帕霉素与顺铂联合用药HIF-1αmRNA的表达为0.242±0.048,单独用药雷帕霉素组为0.428±0.068,顺铂组为0.357±0.051;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF mRNA的表达为0.498±0.093,单独用药雷帕霉素组为0.651±0.112,顺铂组为0.623±0.125,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05;雷帕霉素与顺铂联合用药组HIF-1α蛋白的表达为0.514±0.092,单独用药雷帕霉素组为0.625±0.132,顺铂组为0.635±0.120;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF蛋白的表达为0.409±0.082,单独用药雷帕霉素组为0.650±0.114,顺铂组为0.623±0.102,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05。结论:单独及联合应用雷帕霉素与顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长均有抑制作用,两药联合应用有明显的协同作用,雷帕霉素联合顺铂具有明显下调HIF-1α、VEGF基因和蛋白表达的作用。     

T肽增强顺铂肿瘤杀伤作用的研究及机制探讨

背景与目的 T肽是Tuftsin的衍生物,其基本功能是刺激巨噬细胞,提高巨噬细胞吞噬及分泌能力,通过增强效应细胞的细胞杀伤作用而被广泛用于多种恶性肿瘤术后抗肿瘤治疗.本研究旨在探讨T肽与化疗药物顺铂的联合能否提高铂类药物的抗肿瘤疗效及机制.方法 应用酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)T肽和/或顺铂处理人巨噬细胞株U937后肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)分泌水平的变化;应用裸鼠荷瘤动物模型,分析T肽和/或顺铂处理小鼠肿瘤变化情况以及小鼠用药期间外周血中巨噬细胞变化情况.结果 ①应用ELISA检测发现在T肽组和T肽联合顺铂组中,U937细胞培养液中TNF-α水平明显高于对照组和顺铂组;T肽联合顺铂组中IFN-γ水平明显高于对照组、顺铂组和T肽组;②在小鼠荷瘤模型中,T肽联合顺铂组的肿瘤体积明显小于对照组、顺铂组和T肽组,并且小鼠没有明显的体重下降;③在小鼠外周血的检测分析中发现,T肽联合顺铂组中活化巨噬细胞数呈现增长趋势.免疫组化分析各组中肿瘤组织Ki67显示T肽联合顺铂组抑制肿瘤细胞增殖.结论 T肽能够促进巨噬细胞增殖和促进其分泌肿瘤细胞杀伤因子(TNF-α、IFN-γ);在体内动物模型中,T肽能够提高化疗药物如顺铂的疗效,使联合组具有更强的肿瘤抑制作用,同时能够减轻化疗药物的毒副作用.     

恶性胸腔和腹腔积液中ERCC1和BRCA1 mRNA的表达水平与顺铂敏感性的关系

目的:本研究旨在探讨肿瘤特殊转移灶恶性胸腔/腹腔积液中核苷酸切除修复交叉互补组1(excision repair cross-complementing group 1, ERCC1)基因和乳腺癌易感基因1(breast cancer 1, BRCA1)的表达水平与顺铂体外药物敏感性之间的关系.方法:前瞻性收集46例Ⅳ期恶性肿瘤患者的恶性胸腔/腹腔积液,分离出肿瘤细胞后,采用体外药敏试验三磷酸腺苷生物荧光法检测(adenosine triphosphate-bioluminescence assay, ATP-TCA)法检测肿瘤细胞对顺铂的药物敏感性,实时荧光定量PCR检测ERCC1和BRCA1 mRNA的相对表达水平.结果: 在非小细胞肺癌患者的恶性胸腔/腹腔积液中,肿瘤细胞的ERCC1 mRNA相对表达水平与顺铂抗药性呈正相关(P=0.001,r=0.685).非小细胞肺癌患者(P=0.014,r=0.541)和胃癌患者(P=0.002,r=0.625)恶性胸腔/腹腔积液中肿瘤细胞的BRCA 1 mRNA相对表达水平与顺铂抗药性呈正相关.ERCC1和BRCA1对顺铂药物敏感性的影响存在交互作用(所有患者P=0.010;胃癌患者P=0.027).结论:恶性胸腔/腹腔积液中肿瘤细胞的ERCC1和BRCA1 mRNA的相对表达水平与顺铂体外药物敏感性相关.联合检测ERCC1和BRCA1这2种基因较只采用其中一种基因在预测顺铂药物敏感性方面的价值更大.     

宫颈癌和食管癌细胞DNA损伤后相关基因表达的改变

目的:研究宫颈癌和食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞DNA损伤前后相关基因的表达.方法:宫颈癌Hela细胞和5种ESCC细胞(YES 2、KYSE 30、YSE 70、KYSE 150和EC 9706)用10 Gy X-ray照射,用顺铂处理ESCC细胞,以达到DNA损伤.提取DNA损伤前后各细胞的RNA和ESCC细胞系的蛋白.用RT-PCR方法检测Aurora-A、p21、Gadd 45a、Bax和Pirh-2基因的转录表达,用Western blot和RT-PCR方法检测ESCC细胞p53基因转录和蛋白表达.结果:Hela细胞经X线照射后Aurora-A、Pirh2基因表达减弱,p21、Gadd45a表达轻度上升;ESCC细胞X线照射后YES 2中Aurora-A表达增强,其余4种细胞Aurora-A表达减弱;顺铂处理后KYSE 30、KYSE 150细胞的p53蛋白表达和p53、p21表达升高,其余基因和另外3种细胞的蛋白及基因表达没有变化.结论:不同种类的肿瘤细胞系和同一肿瘤不同细胞系细胞对DNA损伤有不同反应.     

塞来昔布对宫颈癌细胞的化疗增敏作用

目的探讨特异性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对顺铂诱导宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡的作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）,测定塞来昔布对顺铂诱导Hela细胞增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测Hela细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果 5、10μmol/L的塞来昔布分别与顺铂联合应用,可增强顺铂对Hela细胞增殖抑制作用。塞来昔布（5μmol/L）能促进顺铂诱导Hela细胞的凋亡。塞来昔布作用于Hela细胞后,Bcl-2蛋白表达水平下调、Bax蛋白表达水平上调呈浓度依赖关系。结论塞来昔布能促进顺铂对Hela细胞增殖抑制和诱导凋亡作用,起化疗增敏作用,可能与其下调Bcl-2蛋白表达水平、上调Bax蛋白表达水平有关。     

miR-148a靶向STAT3对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗敏感度的增强作用

目的 探究miR-148a对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗敏感度的影响及相关机制。方法 体外培养宫颈癌HeLa细胞,设置顺铂浓度梯度检测IC20值;设置对照组、mimic对照组、miR-148a mimic组、inhibitor对照组和miR-148a inhibitor组,转染后使用qRT-PCR法检测miR-148a和STAT3 mRNA表达;4 μmol/L顺铂处理后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,Western blot法检测p-STAT3/STAT3、CyclinD1、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达。结果 HeLa细胞的顺铂IC20约为4 μmol/L。与mimi c 对照组相比,miR- 1 4 8 a mimic组HeLa细胞中miR-148a水平显著升高,STAT3 mRNA水平显著降低（P<0.05）;与inhibitor对照组相比,miR-148a inhibitor组HeLa细胞中miR-148a水平显著降低,STAT3 mRNA水平显著升高（P<0.05）。顺铂处理后,与mimic对照组相比,miR-148a mimic组HeLa细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平显著升高,OD值、S期和G2/M期细胞比例及p-STAT3/STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平显著降低（P<0.05）;与inhibitor对照组相比,miR-148a inhibitor组HeLa细胞上述指标均朝相反的趋势显著变化（P<0.05）。结论 miR-148a可通过靶向抑制STAT3增强宫颈癌HeLa细胞的顺铂化疗敏感度。     

姜黄素联合顺铂对宫颈癌裸鼠移植瘤生长及淋巴转移的影响

目的 探讨姜黄素联合顺铂在裸鼠体内的抗宫颈癌作用及其对淋巴转移的影响.方法 建立人宫颈癌 Caski 细胞裸鼠皮下移植瘤模型,采用随机数字表法分为4组:生理盐水对照组(10 ml/kg)、姜黄素组(100 mg/kg)、顺铂组(3 mg/kg)、联合用药组(姜黄素100 mg/kg+顺铂3 mg/kg),计算移植瘤体积、抑瘤率.应用实时荧光定量PCR检测 Caski 细胞裸鼠移植瘤组织中巨噬细胞移动抑制因子(MIF) mRNA及血管内皮生长因子-C(VEGF-C) mRNA的表达.结果 姜黄素组、顺铂组以及联合用药组的抑瘤率分别为40.8％、53.3％和60.0％.治疗15 d后,对照组、姜黄素组、顺铂组、联合用药组肿瘤体积分别为(123.44±35.62)、(71.72 ±28.36)、(65.47±18.32)、(53.44±10.79) mm3,姜黄素组、顺铂组及联合用药组裸鼠肿瘤体积增长相对缓慢,联合用药组能更有效地抑制裸鼠肿瘤体积增长,4组间比较差异有统计学意义(F=16.890,P=0.000).实时荧光定量PCR检测显示,相对于对照组(1.000),姜黄素组、顺铂组、联合用药组MIF mRNA相对表达量分别是0.322±0.094、0.154±0.006、0.136±0.007,差异有统计学意义(F=220.279,P=0.000),VEGF-C mRNA 相对表达量分别是0.312±0.068、0.263±0.072、0.221±0.041,组间比较差异有统计学意义(F=143.250,P=0.000);并且MIF mRNA与VEGF-C mRNA之间存在正相关(r=0.815,P=0.001).结论 姜黄素联合顺铂能够明显抑制人宫颈癌Carski细胞裸鼠移植瘤的生长,其通过下调MIF mRNA和VEGF-C mRNA的表达,进而抑制宫颈癌淋巴转移可能是其抗肿瘤作用的重要机制之一.     

维甲酸逆转人宫颈癌耐药细胞株耐药性的实验研究

目的 :本研究旨在探讨全反式维甲酸 (ATRA)逆转人宫颈癌Hela/MMC耐药株对MMC的耐药作用。方法 :观察ATRA作用下Hela/MMC细胞的增殖 ,采用MTT法观察ATRA对Hela/MMC药物敏感性的影响 ,半定量RT PCR检测mdrI基因的表达情况。结果 :ATRA能提高MMC对Hela/MMC细胞的杀伤作用 ,上调细胞mdr1mRNA的表达。结论 :ATRA能逆转Hela/MMC对MMC的耐药性 ,但这种作用与mdrl基因表达无关     

STAT3诱导巨噬细胞M2型极化促进宫颈癌细胞的放疗抵抗及机制研究

目的:探究STAT3诱导的巨噬细胞极化对宫颈癌细胞放疗抵抗的影响及机制。方法:THP1与100 ng/mL PMA孵育48 h诱导其分化为M0型巨噬细胞,LPS诱导M0型巨噬细胞分化为M1型,IL-4诱导M0型巨噬细胞分化为M2型,qRT-PCR和Western blot检测M0、M1、M2型巨噬细胞中STAT3表达,M0型巨噬细胞中转染空白质粒（对照组）和STAT3过表达质粒（STAT3组）,qRT-PCR检测各组细胞Arg-1、CD206、IL-1β和TGF-β mRNA表达,Western blot检测STAT3、SOCS3表达以及STAT3磷酸化水平,克隆形成实验检测0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 6 MV-X射线照射剂量下宫颈癌细胞Hela和SiHa的克隆形成率（PE）和细胞存活分数（SF）,将M0、M1、M2型巨噬细胞以及对照组和STAT3组巨噬细胞与Hela和SiHa细胞共孵育后,用6 Gy剂量照射Hela和SiHa细胞,CCK8法检测照射后Hela和SiHa细胞的增殖能力。结果:M0、M1、M2型巨噬细胞诱导成功,M2型巨噬细胞中STAT3高表达（P＜0.001）,M1型巨噬细胞中STAT3低表达（P＜0.001）,相比于对照组,STAT3组巨噬细胞中Arg-1、CD206、IL-1β、TGF-β、SOCS3表达显著上调（P＜0.001）,STAT3磷酸化水平显著增加（P＜0.001）。不同剂量（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）照射后,Hela和SiHa细胞的PE、SF水平随照射剂量升高而逐渐降低（P＜0.05）,6 Gy和8 Gy条件下PE和SF无显著差异。在6 Gy照射剂量下,相比于M0型和对照组巨噬细胞共孵育的Hela和SiHa细胞,M2型巨噬细胞和STAT3组巨噬细胞共孵育后的Hela和SiHa细胞增殖能力显著增加（P＜0.05）。结论:STAT3可诱导M2型巨噬细胞极化而增加宫颈癌细胞的放疗抵抗。     

辛伐他汀通过调控Chk1基因的表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响

目的:探讨辛伐他汀（simvastatin,SVA）通过调控细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase 1,Chk1）基因表达对宫颈癌细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响。方法:体外培养宫颈癌Hela细胞，采用不同浓度（3.25 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)SVA处理细胞，以0 μmol/L SVA为空白组（Con组）。采用MTT法检测SVA对细胞的增殖抑制率，筛选SVA最适浓度（SVA组）用于后续研究。流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用2、4、6、8 Gy剂量X射线照射细胞。将Chk1阴性对照质粒、Chk1 siRNA分别转染至Hela细胞，分别命名为si-NC、si-Chk1组；重组pcDNA 3.1/Chk1基因过表达质粒及空载体对照质粒分转染至SVA组细胞中，分别命名为SVA+pcDNA-Chk1组、SVA+pcDNA组。采用qRT-PCR与Western blot法检测各组细胞中Chk1 mRNA及蛋白表达水平；MTT法检测各组细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞凋亡情况；克隆形成实验检测细胞放疗敏感性。结果:随着SVA浓度的增加Hela细胞增殖抑制率明显升高且呈剂量依赖性，SVA浓度为12.5 μmol/L时Hela细胞增殖抑制率约为50%，以此用作后续实验研究。SVA组Hela细胞凋亡率显著高于Con组，且不同剂量X射线照射后Hela细胞存活分数明显降低（P＜0.05）；SVA处理Hela细胞后可显著降低Chk1 mRNA及蛋白表达水平（P＜0.05）；si-Chk1组Hela细胞中Chk1蛋白表达水平及细胞存活分数均显著低于si-NC组（P＜0.05），细胞增殖抑制率及凋亡率均显著升高（P＜0.05）；SVA+pcDNA-Chk1组Hela细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均显著低于SVA+pcDNA组（P＜0.05），细胞存活分数显著升高（P＜0.05）。结论:SVA可通过下调Chk1基因表达进而抑制宫颈癌细胞增殖并促使细胞凋亡，同时能够增强宫颈癌细胞放疗敏感性。     

环孢素A调控自噬诱导肿瘤相关巨噬细胞极化干预子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为

目的:探究环孢素A（CsA）对肿瘤相关巨噬细胞极化的调控作用及其与子宫内膜癌（EC）细胞恶性生物学行为之间的联系,并初步探讨相关机制。方法:采用佛波酯（PMA）和白细胞介素-4（IL-4）诱导THP-1细胞向具有肿瘤相关巨噬细胞极化分型特点的M2样巨噬细胞分化,分别以50、100、150、200 ng/mL CsA处理诱导后的细胞24 h,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测CD86和CD206表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β)、重组人精氨酸酶1（Arg-1)的mRNA相对表达量。将人子宫内膜癌Ishikawa细胞随机分为4组并进行相应处理:对照组,Ishikawa细胞加入细胞培养液培养24 h;CsA组,200 ng/mL CsA干预Ishikawa细胞24 h;肿瘤相关巨噬细胞（TAM）组,肿瘤相关巨噬细胞培养液上清干预Ishikawa细胞24 h;CsA+TAM组,经200 ng/mL CsA处理肿瘤相关巨噬细胞的培养液上清干预Ishikawa细胞24 h。处理结束后,CCK-8法检测细胞活性,Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western Blotting检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色检测自噬标记物LC3表达,透射电子显微镜观察自噬体形成。结果:经过不同浓度CsA处理肿瘤相关巨噬细胞后,细胞存活率未发生变化（P＞0.05）,而细胞中CD86表达增加、CD206表达下降,iNOS、TNF-α的mRNA相对表达量升高,TGF-β、Arg-1的mRNA相对表达量降低（P＜0.01）;与对照组比较,CsA组Ishikawa细胞存活率下降,迁移数目与侵袭数目减少,细胞凋亡率增加,Beclin-1蛋白表达下降、p62蛋白表达增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调,LC3荧光表达减弱,细胞内未见自噬体,而TAM组细胞迁移数目与侵袭数目增加,细胞凋亡率减少,Beclin-1蛋白表达增加、p62蛋白表达下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,LC3荧光表达增强,细胞内自噬体数目较多（P＜0.01）;与TAM组比较,CsA+TAM组细胞存活率下降,迁移数目与侵袭数目减少,细胞凋亡率增加,Beclin-1蛋白表达下降、p62蛋白表达增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调,同时,LC3荧光表达减弱,细胞内自噬体减少（P＜0.01）。结论:CsA通过调控肿瘤相关巨噬细胞的极化,抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移与侵袭能力,其机制可能与细胞自噬水平相关。     

缺氧诱导的结直肠癌外泌体通过激活PTEN/PI3Kγ信号通路介导巨噬细胞极化

目的:探究缺氧条件下,结直肠癌细胞外泌体对巨噬细胞极化的影响及机制。方法:差速离心法提取正常条件下和缺氧条件下结直肠癌细胞HT-29所分泌的外泌体（HT-29 N-exo和HT-29 H-exo）,透射电镜和Western blot鉴定外泌体,荧光显微镜下观察外泌体的摄取。将U937细胞与100 ng/mL的PMA共孵育的同时分别与1 μg/mL的HT-29 N-exo和HT-29 H-exo以及等体积的PBS共孵育,记为PBS组、HT-29 N-exo组、HT-29 H-exo组。qRT-PCR检测各组细胞CD163、IL-10、IL-1Rα、TGF-β1、CCL2、TNF-α mRNA的表达,Elisa检测各组细胞IL-10 和 TNF-α 分泌,流式细胞术鉴定各组细胞CD163和CD11b表达,Western blot检测各组细胞PTEN/PI3Kγ信号通路激活情况。结果:差速离心法所提取的外泌体符合其结构和生物学特征,并且可被U937细胞摄取;相比于HT-29 N-exo组, HT-29 H-exo组细胞CD163、IL-10、IL-1Rα、TGF-β1、CCL2表达显著增加（P＜0.05）,IL-10分泌显著增加,TNF-α 表达以及分泌显著减少（P＜0.01）,CD163+CD11b+巨噬细胞数显著增加（P＜0.001）,PTEN/PI3Kγ信号通路显著激活（P＜0.001）。结论:缺氧条件下结直肠癌细胞外泌体能够显著促进巨噬细胞M2型极化,其机制为激活PTEN/PI3Kγ信号通路。     

miRNA-409-3p表达水平对宫颈癌细胞增殖及顺铂化疗敏感性的影响

目的 探讨微小RNA-409-3p(miRNA-409-3p)表达水平对宫颈癌细胞增殖及顺铂化疗敏感性的影响。方法 将HeLa细胞分为正常对照组、NC对照组和miRNA-409-3p mimic组,RT-PCR法检测不同宫颈组织及转染miRNA-409-3p mimic后各组细胞中miRNA-409-3p mRNA的表达,CCK-8法检测细胞增殖率,Western blot法检测Fip200、LC3、Caspase-3蛋白的表达。结果 宫颈癌组织中miRNA-409-3p mRNA的相对表达水平显著低于正常宫颈组织和癌旁组织(P＜0.05);通过转染miRNA-409-3p mimic后,miRNA-409-3p mimic组miRNA-409-3p mRNA的相对表达水平较正常对照组显著上调(P＜0.05),NC对照组miRNA-409-3p mRNA的相对表达水平较正常对照组无统计学差异(P＞0.05)。miRNA-409-3p mimic组HeLa细胞增殖率较正常对照组和NC对照组显著降低(P＜0.05)。给予顺铂干预后,miRNA-409-3p mimic组细胞增殖显著被抑制(P＜0.05);同时,miRNA-409-3p mimic组细胞中Fip200蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著低于正常对照组和NC对照组(P＜0.05)。结论 miRNA-409-3p在宫颈癌组织中低表达,可能与宫颈癌的发生发展有关,上调miRNA-409-3p水平可以抑制HeLa细胞增殖,增加HeLa细胞对顺铂的敏感性。     

毛蕊异黄酮通过Nrf2/HO-1信号途径诱导人甲状腺癌FTC-133细胞发生铁死亡

目的:观察毛蕊异黄酮（CA）是否可诱导人甲状腺癌细胞系FTC-133细胞铁死亡并探讨其可能机制。方法: 采用RPMI 1640培养液培养FTC-133细胞,分为对照和CA、铁死亡抑制剂ferrostatin-1、血红素氧合酶-1（HO-1）激动剂CoPP、CA+ferrostatin-1和CA+CoPP组。CCK-8法检测细胞增殖。相应试剂盒检测细胞活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、总铁和二价铁离子水平。Western Blot检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、铁蛋白重链1（FTH1）、核因子E2相关因子2（Nrf2）和HO-1蛋白表达。结果:与对照组比较,CA（50、100和150 μmol/L）处理在24 h、48 h和72 h三个时间点均降低细胞存活率,并呈现剂量依赖性（均P＜0.05）。与对照组比较,CA（50、100和150 μmol/L）处理48 h降低细胞中GSH的浓度（均P＜0.05）,增加了FTC-133细胞中ROS、MDA、总铁和二价铁离子浓度（均P＜0.05）。与对照组比较,CA（50、100和150 μmol/L）处理48 h显著降低细胞中GPX4（P＜0.05）和FTH1（P＜0.05）蛋白表达水平（均P＜0.05）。Ferrostatin-1部分逆转了CA诱导FTC-133细胞铁死亡的作用（均P＜0.05）。与对照组比较,CA（50、100和150 μmol/L）处理均降低Nrf2在细胞核中的表达及Nrf2在细胞核中表达与Nrf2总蛋白表达的比值（均P＜0.05）,而没有影响Nrf2总蛋白表达（均P＞0.05）。与对照组比较,CA（50、100和150 μmol/L）处理均降低细胞中HO-1的蛋白表达（均P＜0.05）。CoPP部分逆转了CA诱导FTC-133细胞铁死亡的作用（均P＜0.05）。结论:CA诱导了人甲状腺癌细胞系FTC-133细胞发生铁死亡,而其机制可能是通过Nrf2/HO-1信号通路。     

三阴性乳腺癌细胞源性外泌体活化的巨噬细胞促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭

目的:研究三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）细胞来源的外泌体对巨噬细胞极化作用以及经外泌体活化的巨噬细胞对TNBC细胞迁移和侵袭能力的影响及作用机制。方法:提取TNBC细胞BT-549和MDA-MB-231外泌体,透射电镜、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）、蛋白质印记(Western blot)鉴定外泌体;流式细胞术检测经外泌体处理后巨噬细胞分子标志物CD206、CD80的表达;实时荧光定量PCR检测单核细胞THP-1、巨噬细胞M0及外泌体处理后巨噬细胞中CD163、转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的mRNA水平;Transwell实验分析外泌体活化的巨噬细胞对TNBC细胞迁移和侵袭的影响,Western blot方法检测MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin的蛋白水平。结果:透射电镜下BT-549和MDA-MB-231细胞的外泌体具有膜结构囊状小泡并表达外泌体的分子标记物CD81、CD63;BT-549细胞来源的外泌体直径分布为80~150 nm,MDA-MB-231细胞来源的外泌体直径分布为100~200 nm;经BT-549和MDA-MB-231细胞源性外泌体处理的巨噬细胞与M0相比,CD206均有稳定表达（P＜0.05),而CD80表达未见明显差异;外泌体处理后巨噬细胞的CD163、TGF-β mRNA表达水平均增加（P＜0.01),iNOS mRNA表达水平降低（P＜0.05),TNF-α mRNA表达水平未见明显变化;外泌体处理后的巨噬细胞使得TNBC细胞的迁移、侵袭穿膜数目增加(P＜0.01),N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表达增加（P＜0.05),E-cadherin 蛋白表达降低（P＜0.05)。结论:TNBC细胞分泌的外泌体可以诱导巨噬细胞向M2极化,进而促进TNBC细胞间质转化,增强TNBC细胞的迁移和侵袭能力。     

miR-362靶向Six1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移的作用机制研究

目的 探讨miR-362靶向Six1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移的作用机制。方法 选取本院宫颈癌患者142例,测定宫颈癌组织及癌旁组织中miR-362的表达水平;同时设Hela癌细胞组、miR-362mimics组、miR-362inhibitor组,测定各组癌细胞活力、癌细胞单克隆形成数目、癌细胞凋亡率、细胞周期、穿膜孔数以及Hela宫颈癌液miR-362、Six1 mRNA水平。结果 宫颈癌组织中miR-362 mRNA表达水平低于癌旁组织(P＜0.05)。有淋巴血管间隙浸润、病理学分期越高、TNM分期越高、有淋巴结转移、浸润深度越深,miR-362mRNA表达率越低(P＜0.05)。miR-362mimics组OD值、存活率水平低于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362inhibitor组OD值、存活率水平高于Hela癌细胞组、miR-362mimics组(P＜0.05)。miR-362mimics组克隆形成数目低于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362inhibitor组克隆形成数目高于Hela癌细胞组、miR-362 mimics组(P＜0.05)。miR-362mimics组细胞凋亡率高于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362 inhibitor组细胞凋亡率低于Hela癌细胞组、miR-362mimics组(P＜0.05)。miR-362mimics组G₁期高于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362inhibitor组G₁期低于Hela癌细胞组、miR-362 mimics组(P＜0.05)。miR-362 mimics组细胞穿膜数低于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362 inhibitor组穿膜数高于Hela癌细胞组、miR-362mimics组(P＜0.05)。miR-362 mimics组miR-362 mRNA表达水平高于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362 inhibitor组miR-362 mRNA表达水平低于Hela癌细胞组、miR-362mimics组(P＜0.05)。miR-362 mimics组Six1 mRNA表达水平低于Hela癌细胞组(P＜0.05),miR-362inhibitor组Six1 mRNA表达水平高于Hela癌细胞组、miR-362mimics组(P＜0.05)。结论 miR-362在宫颈癌的发生和发展过程中发挥了肿瘤抑制作用;其机制与miR-362通过负调节Six1抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭有关。     

HSPA5通过抑制铁死亡调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡

目的:探讨热休克蛋白70蛋白5（heat shock 70 kDa protein 5，HSPA5）通过铁死亡对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot，WB）检测HSPA5和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)在宫颈癌和癌旁组织中的表达情况，通过TCGA数据库分析所有宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌（CESC）中HSPA5与患者总生存率间的相关性。体外培养人宫颈癌HeLa和SiHa细胞系，分别感染shHSPA5和shCtrl慢病毒，构建稳定的宫颈癌HSPA5敲低株，用qRT-PCR和WB检测HSPA5敲低之后铁死亡相关蛋白GPX4的表达情况。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）或激活剂Erastin处理细胞后，采用CCK-8和EdU检测细胞增殖情况；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH含量；还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒分别测定GSH和MDA含量；流式细胞术检测细胞凋亡及活性氧（ROS）的情况。结果:与癌旁组织相比，宫颈癌组织中HSPA5与GPX4的表达显著升高，HSPA5高表达与患者预后不良有关；在HeLa和SiHa细胞中敲低HSPA5能够抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡；同时细胞内ROS、MDA和LDH的水平上调；HSPA5敲低后GPX4的mRNA和蛋白表达水平同时降低，此外细胞内GSH的含量降低；铁死亡抑制剂Fer-1逆转了HSPA5敲低导致的ROS和LDH的含量升高并抑制细胞凋亡；铁死亡激活剂Erastin和HSPA5敲低联合增加了细胞凋亡并抑制细胞增殖。结论:HSPA5在宫颈癌组织中表达上调，通过敲低HSPA5可激活铁死亡从而抑制宫颈癌细胞的增殖和促进细胞凋亡。