MiR-300对骨肉瘤细胞增殖与凋亡作用研究

目的 骨肉瘤具有局部高度侵袭能力以及快速转移潜能,因而致死率较高.研究指出,miR-300的表达异常与多种肿瘤的发病相关.miR-300对骨肉瘤细胞是否存在调控作用却属未知.本研究探讨miR-300对骨肉瘤细胞Saos-2增殖与凋亡调控的作用.方法 将miR-300转染进骨肉瘤细胞Saos-2中,实现miR-300在Saos-2细胞内的高表达.通过荧光定量PCR测定miR-300在细胞内的表达水平;分别采用MTT活细胞测试,细胞周期实验和克隆形成实验检测骨髓瘤细胞的增殖情况;通过蛋白质印迹法测定Bcl-2、Bax和Bak,裂解型Caspase-3蛋白水平来鉴定细胞凋亡.结果 转染miR-300的Saos-2细胞,其miR-300表达量为对照组的(10.23±1.04)倍,t=3.613 8,P=0.000 6.MTT实验结果显示,在转染后24和48 h,miR-300组的Saos-2相对活细胞百分比相对对照组分别为[(174.35±28.46)％,t=2.219,P=0.03]和[(225.73±24.62)％,t=2.738,P=o.008].miR-300组Saos-2细胞处在G1期的百分比为39.42％,低于对照组的47.58％,t=2.366,P=0.021;而处在G2期的细胞百分比为19.12％,显著高于对照组的10.55％,t=2.987,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞克隆形成率为(52.53±30.21)％,显著高于对照组的(24.67±2.05)％,t=2.711,P=0.008 6.miR-300组Saos-2细胞中Bax、Bak和裂解型Caspase-3表达水平分别为对照组的(0.25±0.02)倍(t=2.785,P=0.007)、(0.31±0.03)倍(t=3.223,P=0.002)和(0.36±0.03)倍(t=3.006,P=0.003 8),差异有统计学意义.Bcl-2蛋白水平为对照组的(6.32±0.57)倍,t=3.218,P=0.002.转染miRZip lent-shMiR-300的Saos-2细胞,其miR-300数量为对照组的(0.28±0.03)倍,t=3.531,P=0.000 78.转染24 h后,miR-300组Saos-2相对活细胞数为对照组的(64.46±5.32)％,t=2.324,P=0.024;48 h后为对照组的(48.14±4.38)％,t=3.009,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞处在G1期的百分比为55.71％,高于对照组的46.78％,t=2.108,P=0.039;处在G2期的细胞百分比为2.81％,低于对照组的11.46％,t=3.224,P=0.002.miR-300组的Saos-2细胞的克隆形成率为(17.63±3.89)％,显著低于对照组的(26.84±2.94)％,t=2.989,P=0.004.miR-300组Saos-2细胞中Bax表达水平为对照组的(6.25±4.23)倍,t=3.138,P=0.002 6;Bak表达水平为对照组的(6.03±4.27)倍,t=3.395,P=0.001 2;裂解型Capase-3表达水平为对照组的(5.35±0.37)倍,t=3.017,P=0.003 7;而Bcl-2蛋白水平为对照组的(0.36±0.02)倍,t=2.769,P=0.007 4.结论 miR-300在骨肉瘤细胞的增殖与凋亡调控中具有重要作用,抑制miR-300表达可以一定程度上减少骨髓瘤细胞的增殖,促进其凋亡,为骨肉瘤的病理机制研究提供了新研究方向.     

PFKFB3通过调控PI3K/AKT信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖及转移

目的:探讨6-磷酸果糖2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,及可能的作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR法、蛋白质印迹法及免疫组织化学法检测骨肉瘤组织及其相应癌旁组织以及骨肉瘤U2-OS、Saos-2、MG-63和143B细胞(以正常成骨细胞hfoBI-19为对照)中PFKFB3 mRNA及蛋白的表达水平。采用慢病毒感染的方法将携带特异性针对PFKFB3基因的shRNA(shPFKFB3)转入U2-OS细胞,将携带有PFKFB3全基因的重组慢病毒载体转入Saos-2细胞。分别采用CCK-8法及EdU实验检测沉默或上调PFKFB3基因表达对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,FCM法检测对骨肉瘤细胞的凋亡率的影响,划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验检测对骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力的影响,并进一步通过蛋白质印迹法检测对波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E盒结合锌指蛋白2(E-box binding zinc finger protein 2,ZEB2)以及PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT和其磷酸化蛋白表达水平的影响。用PI3K抑制剂LY294002处理PFKFB3过表达的Saos-2细胞,再用蛋白质印迹法、CCK-8法、FCM法和Transwell小室侵袭实验检测对PI3K/AKT信号通路,Saos-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。结果:PFKFB3 mRNA及蛋白在骨肉瘤组织中的表达水平均明显上调(P值均<0.01)。免疫组织化学法检测结果证实,25例骨肉瘤组织样本中PFKFB3蛋白高表达为19例(19/25,76%),而癌旁正常组织仅有4例(4/25,16%)。成功构建沉默PFKFB3基因表达的U2-OS细胞,PFKFB3基因过表达的Saos-2细胞。沉默PFKFB3基因表达后,U2-OS细胞的增殖、迁移及侵袭能力被明显抑制(P值均<0.05),而细胞的凋亡率被明显提高(P<0.01),转移相关蛋白Vimentin、N-cadherin和ZEB2的表达水平被明显下调,而E-cadherin蛋白的表达水平明显上调;相反上调PFKFB3基因表达后,Saos-2细胞的增殖、迁移及侵袭能力被明显提高(P值均<0.05),而细胞的凋亡率被明显抑制(P<0.05),Vimentin、N-cadherin和ZEB2蛋白的表达水平均明显上调,而E-cadherin蛋白的表达水平明显下调。PI3K抑制剂LY294002处理PFKFB3过表达的Saos-2细胞后,PI3K、AKT以及上调的磷酸化PI3K(phospho-PI3K,p-PI3K)和p-AKT蛋白的表达水平均被明显抑制,Saos-2细胞的增殖及侵袭能力被抑制(P<0.05和P<0.01),而细胞的凋亡率被提高(P<0.05),提示PFKFB3可能通过影响PI3K/AKT信号通路的磷酸化进而促进骨肉瘤生长和转移。结论:PFKFB3可能是骨肉瘤和抗肿瘤靶向治疗的潜在生物标志物。     

ATF5蛋白对食管鳞癌细胞耐药性影响

目的 食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多药耐药严重影响化疗效果,其分子机制仍未阐明.本研究通过构建不同ATF5蛋白表达量的食管癌Eca-109细胞模型,探究过表达ATF5及低表达ATF5对食管癌Eca-109细胞耐药性及凋亡的影响.方法 利用脂质体载体转染技术对食管癌细胞株进行转染,建立高、中(转染空质粒的对照组)、低3组不同ATF5蛋白表达量Eca-109细胞模型.蛋白质印迹法检测3组细胞ATF5蛋白表达水平.MTT实验和平板克隆实验观察3组细胞对紫杉醇、顺铂耐受性的变化;DAPI染料核染色后观察3组细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡反应的差异;分析ATF5蛋白对食管鳞癌Eca-109细胞耐药的影响.结果 利用转染技术成功构建的3组不同ATF5蛋白表达量的Eca-109细胞模型,表达模型组细胞中ATF5蛋白相对表达量为85.9±2.66,对照组为64.35±2.54,低表达模型组为45.3±3.11,3组差异有统计学意义,F=532.323,P＜0.001.MTT实验显示,紫杉醇、顺铂作用72 h后,3组细胞存活率差异有统计学意义,F紫=163.382,P＜0.001;F顺 =579.36,P＜0.001;同一组细胞不同浓度对存活率的影响差异有统计学意义,F紫=616.32,P＜0.001;F顺 =2 558.05,P＜0.001;不同浓度的紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的半数抑制率浓度(IC50)分别为4.16±2.21和1.54±0.67;对照组分别为1.54±0.92和1.27±0.65;低表达组细胞的半数抑制率浓度分别为0.33±0.21和0.53±0.62,3组差异有统计学意义,F紫=198 330.768,P＜0.001;F顺=64 298.048,P＜0.001;表明过表达ATF5的细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显升高而低表达模型组细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显降低.DAPI染色实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的凋亡率分别为(14.04±1.66)％和(11.75±2.09)％;对照组分别为(26.44±2.99)％和(34.07±3.42)％;低表达组细胞的凋亡率分别为(54.85±5.88)％和(66.66±2.81)％,3组差异有统计学意义,F紫=283.976,P＜0.001;F顺=954.464,P＜0.001.提示过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均减少,低表达ATF5细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均增加.平板克隆形成实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的克隆形成率分别为(56.09±1.37)％和(62.67±1.41)％;对照组分别为(38.7±1.37)％和(34.83±3.09)％;低表达组细胞的克隆形成率分别为(25.22土1.58)％和(18.17±3.64)％,3组差异有统计学意义,F紫 =1157.447,P＜0.001;F顺=612.595,P＜0.001.表明过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数均更多,低表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数减少.结论 上调ATF5蛋白的表达能增加食管鳞癌Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,而下调ATE5蛋白的表达则能降低Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,提示食管鳞癌细胞的耐药性可能与ATF5蛋白的表达量相关,食管鳞癌细胞中ATF5蛋白的表达情况可能能间接干扰临床药物化疗的效果.     

G蛋白偶联受体54基因在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的:研究G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPR)54基因的表达与骨肉瘤生物学行为和临床预后的关系。方法:应用RT-PCR检测3种人骨肉瘤细胞(MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞)和正常人成骨hF-OB1.19细胞中GPR54 mRNA的表达情况,免疫组织化学技术检测44例骨肉瘤和12例骨软骨瘤组织中GPR54蛋白的表达情况,应用Transwell侵袭实验比较不同骨肉瘤细胞的侵袭、迁移能力。结果:在人骨肉瘤MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞和正常人成骨hF-OB1.19细胞中,GPR54mRNA表达水平均较高,各组细胞间差别无统计学意义[(0.87±0.05)、(0.88±0.07)、(0.88±0.08)、(0.86±0.05),P>0.05]。骨肉瘤MG-63、Saos-2、U-2 OS细胞侵袭、迁移细胞数逐渐降低[(61.00±7.15)vs(32.40±5.36)、(18.10±3.21)个,P<0.05或P<0.01]。人骨肉瘤组织中GPR54蛋白表达阳性率显著高于骨软骨瘤组织(81.82%vs 41.67%,P<0.05)。GPR54蛋白阳性表达的骨肉瘤患者平均生存期明显短于GPR54蛋白阴性表达的患者[(27.39±6.05)vs(40.33±4.88)月,P<0.05]。结论:GPR54基因在骨肉瘤组织中的表达阳性率增高,且与患者临床生存期呈负相关。     

miR-186通过下调垂体瘤转化基因1的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡

目的:探讨miR-186对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,并探讨其可能机制.方法:实时荧光定量PCR检测骨肉瘤细胞HOS、U2-OS、Saos-2及成骨细胞NHOst中miR-186表达,并运用人工合成的miR-186模拟片段及对照scramble mimic转染至人骨肉瘤HOS及U2-OS细胞内,运用实时荧光定量PCR检测转染后细胞中miR-186的表达水平;分别运用CCK-8法、流式细胞检测技术及Transwall体外侵袭实验检测过表达miR-186对HOS及U2-OS细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响;运用Westem blotting及实时荧光定量PCR检测miR-186过表达对细胞中垂体瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)的蛋白及mRNA表达水平的影响.结果:骨肉瘤细胞中miR-186呈现低表达;转染人工合成的miR-186片段可上调HOS及U2-OS细胞中miR-186的表达;miR-186过表达组细胞的增殖能力较scramble组明显下降(P＜0.01),转染组HOS[(16.9±2.1)％ vs(10.4±1.6)％,P＜0.05]及U2-OS[(22.6±2.9)％ vs (14.1±2.2)％,P＜0.05]细胞的凋亡比例明显高于scramble组,转染组HOS及U2-OS细胞的穿膜数明显低于scramble组(P＜0.01);转染组细胞中PTTG1的蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P＜0.01),而scramble组无明显变化(P＞0.05);结论:miR-186能够抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭并促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PTTG1表达相关.     

膀胱癌细胞Cx43对顺铂抗肿瘤作用影响研究

目的 连接蛋白43(connexin43,Cx43)在人体正常组织及肿瘤组织中广泛表达,并且参与细胞的生长控制和组织分化.本研究探讨采用RNA干扰技术沉默膀胱癌5637细胞株Cx43蛋白表达对顺铂化疗敏感性的影响.方法 体外培养膀胱癌5637细胞和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞,采用蛋白质印迹法检测膀胱癌5637细胞系和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞中Cx43蛋白表达,应用免疫荧光技术检测膀胱癌5637细胞系中Cx43蛋白的定位.采用RNA干扰技术沉默膀胱肿瘤5637细胞株Cx43蛋白的表达并用顺铂(3μg/mL)处理SiRNA-Cx43组(实验组)和SiRNA-Control(对照组)后,通过CCK-8检测实验组、对照组及野生型5637细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测两组癌细胞的凋亡;采用蛋白质印迹法检测顺铂处理后野生型5637细胞后细胞中Cx43、Cleaved Caspase-3的表达及实验组和对照组中Cx43、Cleaved Caspase-3和Bcl-2的表达.结果 膀胱癌5637细胞中Cx43表达较正常尿路上皮细胞高,相对蛋白表达量分别为1.013±0.102和0.556±0.054,两细胞系比较差异有统计学意义,t=3.789,P=0.019;免疫荧光检测Cx43主要定位于细胞质中.CCK-8结果显示,膀胱癌5637细胞随着顺铂药物的浓度(0.75、1.5、3和6μg/mL)和时间(0、1、2、3 d)的增加,细胞的增殖减少,采用重复测量方差分析,各组间比较,差异有统计学意义,F=153.634,P＜0.001;实验组增殖较对照组明显减少,差异有统计学意义,F=9.949,P=0.02.流式细胞仪检测结果显示,实验组和对照组凋亡率分别为(63.00±4.58)％和(34.33±6.03)％,差异有统计学意义,t=7.457,P＜0.01.蛋白质印迹法结果显示,5637细胞随着药物(顺铂3 μg/mL)作用时间增加,Cx43蛋白表达逐渐降低,差异有统计学意义,F=178.868,P＜0.001;而CleavedCaspase-3逐渐升高,差异有统计学意义,F=21.643,P＜0.001.顺铂(3μg/mL,4h)处理实验组和对照组后,CleavedCaspase-3蛋白相对表达量分别为0.740±0.092和0.373±0.091,差异统计学意义,t=6.394,P=0.001;BclL-2蛋白相对表达量分别为0.260±0.066和0.817±0.068,差异统计学意义,t=4.814,P=0.005 结论 沉默膀胱癌5637细胞中Cx43蛋白表达能提高顺铂的敏感性,可能与反常定位于细胞质中的Cx43参与线粒体介导的凋亡途径有关.     

ZNRF3在甲状腺肿瘤组织中的表达以及在甲状腺癌细胞中的功能研究

目的 检测ZNRF3基因在不同分化程度甲状腺癌组织标本和细胞中的表达情况并探讨其在甲状腺癌中的作用.方法 应用免疫组织化学技术检测35例乳头状甲状腺癌和10例低分化甲状腺癌组织中ZNRF3蛋白的表达.RT-PCR检测ZNRF3基因在乳头状甲状腺癌TPC-1和低分化甲状腺癌8505C细胞株中的表达.通过慢病毒沉默TPC-1细胞中的ZNRF3基因,CCK-8与Transwell分别检测ZNRF3基因沉默后TPC-1细胞株增殖和侵袭迁移情况.结果 免疫组织化学和RT-PCR分别检测发现,ZNRF3基因在乳头状甲状腺癌组织及细胞株中的表达明显高于低分化甲状腺癌组织及细胞,差异有统计学意义(4.83±0.44∶3.13±0.59,t=2.20,P＜0.05;1.01 ±0.06∶0.21 ±0.04,t=11.80,P＜0.01).将TPC-1细胞株中ZNRF3基因沉默后,通过CCK-8检测细胞增殖发现,细胞培养72 h后细胞增殖能力显著增强,差异有统计学意义(0.96±0.10∶0.64±0.05,t=3.19,P＜0.05);并且Transwell检测细胞侵袭与转移发现,细胞侵袭(0.12±0.01∶0.09±0.00,t=5.48,P＜0.01)与迁移能力(0.22±0.01∶0.17±0.01,t=4.58,P＜0.05)有所增强,差异有统计学意义.结论 ZNRF3在乳头状甲状腺癌中的表达高于低分化甲状腺癌,ZNRF3在甲状腺肿瘤的发生发展中为抑癌基因.     

lncRNA HOXA11-AS对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探究长链非编码RNA(long-nocoding RNA,lncRNA) HOXA11-AS在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制.方法:采用2012年1月至2015年12月浙江省人民医院骨外科13例骨肉瘤组织及癌旁正常组织,以及骨肉瘤细胞系MG63、U20S和人成骨细胞株hFOB1.19,用实时荧光定量PCR检测骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系MG63和U20S中lncRNA HOXA11-AS的表达水平.用慢病毒载体构建稳定过表达lncRNA HOXA11-AS的骨肉瘤MG63及U20S细胞,用CCK-8和克隆形成实验、Transwell小室法分别检测过表达lncRNA HOXA11-AS对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响.建立过表达lncRNA HOXA11-AS MG63骨肉瘤细胞裸鼠移植瘤模型,以空载体慢病毒Lv-NC转染的细胞作为对照,观察过表达lncRNA HOXA11-AS对裸鼠移植瘤生长的影响.结果:lncRNA在骨肉瘤组织和MG63及U20S细胞中表达水平显著下调(P＜0.01).与hFOB1.19细胞比,过表达lncRNA HOXA11-AS细胞后,(1)显著抑制骨肉瘤MG63及U20S细胞的增殖[(4.03 ±0.98) vs(6.96 ±0.54),(4.68±0.77) vs (8.87±1.23),均P＜0.01]、迁移细胞数[(83.00 ±6.03) vs(168±12.54),(96.00 ±8.77)vs(184.00±14.63)个,均P＜0.01]和侵袭细胞数[(35.00±3.48) vs (97.00±8.32),(38.00±1.73) vs (87.00±6.37)个,均P＜0.01];(2)显著抑制骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的生长(P＜0.01).结论:lncRNA HOXA11-AS在骨肉瘤细胞中低表达,且lncRNA HOXA11-AS过表达对骨肉瘤的发生发展具有抑制作用,可以作为骨肉瘤治疗潜在的分子靶点.     

RNA结合蛋白HuR调控前列腺癌细胞活力机制的研究

目的 前列腺癌在我国的发病率及病死率逐年上升,但其发病机制尚未明确,本研究从转录后水平初步探讨RNA结合蛋白HuR参与调控前列腺癌细胞活力的机制.方法 免疫荧光检测前列腺增生细胞(BPH)及前列腺癌细胞(PC3)中HuR蛋白的定位,蛋白质印迹法检测HuR及环氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)蛋白在细胞内的表达,MTT法检测细胞活力,脂质体转染法转染质粒及干扰片段,qPCR检测干扰效率,RNA-pull down实验验证HuR对COX-2的调控.结果 HuR在BPH细胞主要定位于细胞核,在PC3细胞中主要定位于胞质.PC3细胞中HuR表达水平为1.699±0.011,高于BPH细胞的0.654±0.028,差异有统计学意义,t=58.67,P＜0.001.PC3细胞中过表达HuR后,转染空质粒组细胞活力为1.038±0.117,转染HuR表达质粒后细胞活力为1.838±0.057,差异有统计学意义,t=10.656,P＜0.001.干扰HuR表达后,转染siNC组细胞活力为1.254±0.095,转染siHuR干扰片段组细胞活力为0.66±0.102,t=7.383,P=0.002;BPH组和PC3组COX-2表达水平分别为0.449±0.055和1.066±0.068,t=12.147,P＜0.001;过表达COX-2后PC3细胞活力明显增加,转染空质粒组细胞活力为1.296±0.114,转染COX-2表达质粒后细胞活力为1.954±0.062,t=18.062,P＜0.001.干扰COX-2表达后,PC3细胞活力明显降低,转染siNC组细胞活力为1.233±0.145,转染siCOX-2干扰片段后细胞活力为0.661±0.096,t=5.688,P=0.005.HuR可以结合于COX-2的3′-UTR并上调COX-2蛋白表达,转染空质粒组COX-2蛋白表达水平为0.638±0.067,转染HuR表达质粒组为1.703±0.022,t=26.26,P＜0.001.结论 HuR参与调控前列腺癌细胞活力可能是通过上调COX-2表达而实现.     

骨肉瘤Kv1.5钾离子通道表达意义的研究

目的 研究表明,Kv1.5钾离子通道参与了多种肿瘤的生物学行为,但其在骨肉瘤中的表达和作用尚未明确.本研究拟检测Kv1.5钾离子通道在骨肉瘤中的表达,并探讨小干扰RNA(small interfering,siRNA)沉默Kv1.5表达后对骨肉瘤细胞增殖、周期和凋亡的影响及可能的调控机制.方法 实验分组,Kv1.5-siRNA转染细胞为实验组,control-siRNA转染细胞为对照组,未处理细胞为空白组.采用siRNA抑制Kv1.5的表达,并分别采用CCK-8法、克隆形成率、流式细胞仪和Tunel法检测MG-63细胞增殖、生长、周期和凋亡的变化.采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测骨肉瘤细胞中周期和凋亡相关基因的表达水平.结果 Kv1.5在骨肉瘤细胞和组织中均异常高表达.CCK-8法检测结果示,Kv1.5-siRNA组细胞增殖水平为(53.87±5.91)％,与control-siRNA组的(99.14±7.87)％相比差异有统计学意义,Z=-3.49,P＜0.001;与空白组(100.00±8.37)％相比差异有统计学意义,Z=-3.57,P＜0.001.克隆形成实验结果示,Kv1.5-siRNA组克隆形成数为164.00±7.66,与control-siRNA组(223.20±11.41)相比,Z=-2.61,P=0.008;与空白组(228.20±12.62)相比,Z=-2.40,P=0.016.流式细胞周期结果示,Kv1.5-siRNA组G0/G1期所占比例为(68.81±0.55)％,与control-siRNA组(41.22±0.61)％相比,Z=-2.15,P=0.031;与空白组(40.79±0.52)％相比,Z=-2.31,P=0.029.流式细胞凋亡结果示,Kv1.5-siRNA组(30.23±1.74)％与control-siRNA组(14.10±1.27)％相比,Z=-2.04,P=0.039;与空白组(12.85±1.02)％相比,Z=-2.09,P=0.035.Tunel法结果示,Kv1.5-siRNA组凋亡指数为(35.20±3.14)％,与control-siRNA组(8.03±1.50)％相比,Z=-2.41,P=0.015;与空白组(8.22±1.32)％相比,Z=2.25,P=0.019.沉默Kv1.5表达可明显下调骨肉瘤中Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、Bcl-2和Bik基因的表达,同时上调p21、p27、Bax、Bcl-XL和Caspase-3基因的表达,与对照组相比,P值均＜0.05.结论 Kv1.5钾离子通道参与了骨肉瘤细胞增殖、周期和凋亡的过程,其作用机制可能与调控周期依赖激酶和Bcl-2家族的相关因子有关.     

p21活化酶5预测骨肉瘤化疗敏感性的实验研究

目的 探讨骨肉瘤组织p21活化酶5（PAK5）表达与新辅助化疗敏感性的关系,从细胞水平验证PAK5是否参与调节骨肉瘤细胞化疗敏感性。方法 采用免疫组化法检测74例骨肉瘤患者活检组织中PAK5表达,分析PAK5表达与骨肉瘤临床病理特征的关系。设计合成siRNA-PAK5,分别转染进入Saos-2和MG63细胞,QPCR和Westtem blotting分别检测PAK5 mRNA和蛋白的表达情况。以不同浓度梯度的阿霉素（ADM 50、25、5、05 μmol／L）、甲氨蝶呤（MTX 50、5、1、0.5、0.05 μmol／L）分别处理Saos-2和MG63细胞,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,计算转染siRNA-PAK5后骨肉瘤细胞半数抑制浓度（IC50）的差异。结果 74例骨肉瘤组织中PAK5阳性57例,阴性17例,PAK5表达与新辅助化疗后肿瘤坏死率及肺转移有关（P＜0.05）。QPCR检测转染组PAK5 mRNA分别水平下降为未转染组29％和31％;Western blotting结果显示转染组PAK5蛋白表达较未转染组下调49％和42％。转染siRNA-PAK5后,ADM作用Saos-2和MG63细胞的IC50分别由（8.35±0.07）μmol／L、（7.35±0.07）μmol／L降至（0.54±0.004）μmol／L、（0.50±0.002）μmol／L （P＜0.05）;MTX作用Saos-2和MG63细胞的IC50分别由（1.255±0.021）μmol／L、（1.05±0.014）μmol／L降至（0.606±0.01）μmol／L、（0.72±0.014）μmol／L （P＜0.05）。结论 骨肉瘤PAK5表达与患者新辅助化疗敏感性相关,抑制骨肉瘤细胞PAK5表达可提高化疗敏感性。     

耐甲氨蝶呤人骨肉瘤细胞株建立及其生物学特性

目的：诱导并建立耐甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）的人骨肉瘤细胞株并观察耐药细胞系（Saos-2／MTXl、Saos-2／MTX2）的生物学特性。方法：以MTX为诱导剂，采用逐步增加药物剂量冲击诱导方法，诱导人成骨肉瘤原代Saos-2细胞株，建立不同药物浓度耐药系（Saos-2／MTX1、Saos-2／MTX2）；MTT法检测原代与耐药细胞株对MTX、顺铂（cisplatin，DDP）、阿霉素（doxorubicin，ADM）、异环磷酰胺（ifosfamide，IFO）、表柔比星（epirubicine，EPI）、比柔比星（pirarubicin，THP）、紫杉醇（paclitaxel，PTX）药物敏感性；利用光学显微镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化；利用细胞生长曲线检测细胞增殖能力；利用流式细胞仪检测细胞周期比例。结果：经178d的诱导，建立Saos-2／MTXl，Saos一2／MTX2耐药细胞株，其对MTX的耐药指数（resisitantdrugindex，RI）分别为原代细胞株的4．87和12．73倍；耐药细胞株对ADM、EPI、THP、PTX产生不同程度的交叉耐药，对DDP敏感；光镜观察Saos-2／MTX1、Saos-2／MTX2细胞体积增大，多核现象较原代Saos-2细胞株明显增加；透射电镜显示Saos-2／MTX1、Saos-2／MTX2细胞株表面突起较原代Saos-2细胞株减少、且核仁增大增多；细胞生长曲线和流式细胞仪检测显示耐药细胞株增殖能力下降，S期细胞所占比例减少（P〈0．05）。结论：本研究建立了耐MTX人成骨肉瘤细胞株Saos-2／MTX1、Saos-2／MTX2，并观察了耐药株细胞的生物学特性，为进一步研究甲氨蝶呤的耐药机制提供了一种实验模型。     

TEAD4对结直肠癌细胞增殖影响及机制探讨

目的 结直肠癌国内外高发,是肿瘤死亡的主要病因之一.TEAD4是YAP/TAZ信号通路中的关键因子.本研究旨在探讨敲低TEAD4的表达后对结直肠癌细胞增殖的影响和机制.方法 通过在结直肠癌细胞系Caco2和HT-29中通过转染TEAD4siRNA和感染慢病毒,以达到瞬时或稳定敲低TEAD4的目的,利用蛋白质印迹方法检测转染效率及相关蛋白的表达.用SRB法分别检测敲低TEAD4后Caco2和HT-29细胞的存活率,以及使用EdU掺入法测定细胞DNA合成效率.结果 在肠癌细胞中使用TEAD4的siRNA,瞬时敲低TEAD4的表达48 h后,蛋白质印迹法检测结果提示,与对照组相比,Caco2(F-99.22,P＜0.001)和HT-29(F=167.3,P＜0.001)细胞中的TEAD4蛋白水平显著降低,同时观察到Caco2(F=45.78,P＜0.001)和HT-29(F=40.71,P＜0.001)细胞中p27蛋白的表达量有明显的上升,蛋白表达差异有统计学意义.SRB结果显示,使用shRNA慢病毒载体稳定敲低肠癌细胞中TEAD4的表达,与对照组细胞相比,2d沉默TEAD4基因的Caco2 (F=142.9,P＜0.001)和HT-29(F=141.0,P＜0.001)细胞的生长速度变慢;于3d后这种抑制作用更加明显,Caco2 (F=394.5,P＜0.001)和HT-29(F=305.1,P＜0.001)细胞增殖速度明显变慢.使用EdU掺入法检测敲低TEAD4后对Caco2和HT-29细胞DNA合成的影响,结果显示,Caco2和HT-29细胞,Caco2/Consi、Caco2/TEAD4si#2、Caco2/TEAD4si#3、HT-29/Consi、HT-29/ TEAD4si#2、HT-29/ TEAD4si#3的DNA合成率分别为(43.20±2.18)％、(27.19±2.34)％和(30.14±1.02)％及(28.23±3.11)％、(11.89±1.20)％和(17.91±2.23)％,干扰组Caco2/TEAD4si# 2(P=0.001)、Caco2/TEAD4si# 3(P＜0.001)、HT-29/TEAD4si# 2(P=0.001)及HT-29/TEAD4si# 3(P=0.011)细胞的DNA合成率显著低于对照组细胞,说明在Caco2和HT-29细胞中敲低TEAD4后,DNA的合成明显受到了抑制.结论 敲低TEAD4对结直肠癌细胞体外增殖和DNA的合成有抑制作用,可能部分通过上调p27的表达,TEAD4可能是结直肠癌发生、发展中潜在的临床诊断或治疗新靶点.     

RIPK4在骨肉瘤组织和细胞中的表达及其意义

目的研究RIPK4（Receptor-interacting protein kinase 4）基因在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞中的表达情况并探讨其表达的临床意义。方法 采用免疫组化染色法检测30例骨肉瘤及10例骨软骨瘤患者瘤组织中RIPK4表达情况,分析其表达与骨肉瘤临床病理特征的关系;RT-PCR检测正常成骨细胞、骨肉瘤MG-63及U-2OS细胞中RIPK4 mRNA表达情况,并比较其差异。结果 30例骨肉瘤中RIPK4阳性表达18例（60.0％）,10例骨软骨瘤中RIPK4阳性表达2例（20.0％）,差异有统计学意义（P＜0.05）。正常成骨细胞中RIPK4 mRNA为0.6500±0.2121,低于骨肉瘤MG-63细胞的1.6079±0.2661及U-2OS细胞的1.5000±0.1414,差异有统计学意义（P＜0.05）。RIPK4蛋白表达与临床分期及是否发生肺转移显著相关,差异有统计学意义（P＜0.05）,而与性别、年龄及病理分型等无关（P＞0.05）。结论 RIPK4 mRNA和蛋白在骨肉瘤组织及细胞中均有较强表达,RIPK4基因可能参与骨肉瘤的发生发展过程。     

Klotho基因对子宫颈鳞癌细胞恶性生物学行为的影响及相关机制

目的:探讨Klotho基因对人子宫颈鳞癌细胞株SiHa生物学特性的影响及其作用机制.方法:实时荧光定量PCR及Western blotting检测Klotho基因在子宫颈鳞癌细胞系SiHa、HeLa和C33A及人永生化表皮细胞HaCaT细胞中的表达水平.构建Klotho过表达载体并转染SiHa细胞,采用CCK-8法、Transwell侵袭实验和流式细胞术检测SiHa细胞增殖、凋亡和迁移能力的变化;Western blotting检测Rho A和ROCK1蛋白表达水平.结果:Klotho在子宫颈癌SiHa、Hela、C33A细胞中表达水平低于HaCaT细胞(P＜0.05).在SiHa细胞中过表达Klotho后,(1)细胞的增殖能力显著低于对照组[(67.37±5.04)％ vs(100.34 ±7.62)％,P＜0.05)];(2)G0/G1期细胞百分率显著增加[(82.56±3.89)％ vs(61.37±3.28)％,P＜0.05]、S期细胞百分率显著减少[(9.12±2.48)％vs(28.97±2.08)％,P＜0.01];(3)细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均显著增加(均P＜0.05);(4)细胞迁移率显著降低(P＜0.01);(5) Rho A和ROCK1蛋白表达水平均显著下降(均P＜0.01).结论:Klotho能够抑制人子宫颈癌SiHa细胞的增殖和迁移,并促进其凋亡;作用机制可能与抑制Rho A/ROCK 1信号通路的活化有关,提示Klotho可以作为诊断和靶向治疗子宫颈癌的潜在作用位点.     

EZH2和H3K27me3的表达对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:通过转染Zeste同源物增强子2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)过表达或者敲低载体,探讨EZH2和Lys27位点三甲基化组蛋白H3(histone H3 methylated Lys27,H3K27me3)对食管麟状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:应用实时荧光定量PCR、Western blotting法检测ESCC细胞株KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109中EZH2 mRNA水平,以及ESCC细胞过表达或者敲低EZH2对H3 K27me3表达水平的影响.用划痕实验及Transwell侵袭实验分析过表达或者敲低EZH2后ESCC细胞的迁移侵袭能力.用实时荧光定量PCR法分析ESCC细胞过表达及敲低EZH2对MMPs mRNA水平的影响.结果:食管癌Eea109及TE1细胞中EZH2和H3K27me3 mRNA和蛋白水平明显高于KYSE30及KYSE170细胞(P＜0.05).过表达EZH2的食管癌KYSE30及KYSE170细胞H3K27me3蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05),敲低EZH2后Eca109及TE1细胞H3 K27 me3蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05).过表达EZH2后,KYSE30及KYSE170细胞的穿膜数目明显增多[(281.33±4.10)、(241.67 ±4.04) vs(132.00 ±4.00)、(105.33 ±3.51)个,均P＜0.05]、迁移距离明显增大[(63.6±1.2)、(62.5±2.5)vs (23.0±2.3)、(21.2±1.0) μm,P＜0.05].敲低EZH2后Eca109及TE1细胞的穿膜数目显著减少(均P＜0.05),转染shEZH2后Eca109及TE1细胞迁移的距离明显减小(均P＜0.05).结论:EZH2可增加靶基因启动子上组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化,并增强ESCC细胞的迁移和侵袭能力.