伴有MSI的结直肠癌TGF-βRⅡ基因突变的研究

目的许多研究表明在伴有微卫星不稳定性(MicroSatellite Instability,MSI)的遗传性结直肠癌中,β-转化生长因子Ⅱ型受体(Transforming Growth Factor-β Type ⅡReceptor,TGF-β RⅡ)基因突变频繁,极可能是其发生的重要机制;并且TGF-RⅡ基因的(A)10重复序列是MSI的靶点.但在散发性结直肠癌中报道较少,本研究通过对散发性结直肠癌的MSI及TGF-RⅡ基因突变的检测,以期了解它们在散发性结直肠癌发生中的作用方法选取单态性很强的BAT-26微卫星位点,应用PCR等分子生物学手段检测MSI;应用PCR-SSCP-银染法-测序检测RⅡ基因突变结果有13例(26%)为MSI,近端(42.11%)明显高于远端者(16.13%)(P＜0.05),RⅡ基因的突变率为10%(5/50),表现为RⅡ基因的(A)10重复序列出现一个A的缺失导致框架移位突变(Frame Shift Mutation),伴有MSI的肿瘤中RⅡ突变率为38.46%,所有RⅡ突变者均伴有MSI,而无MSI的肿瘤中均无RⅡ突变(P＜0.01) 结论不仅在HNPCC中,而且在散发性结直肠癌中,TGF-βRⅡ基因的(A)10重复序列是MSI的靶点.     

抑癌基因PTEN在胃癌及癌前病变中的缺失和突变

目的:探讨胃癌及癌前病变中抑癌基因PTEN的缺失和突变.方法:收集中国医科大学2001～2002年胃镜中心活检标本,萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生及对应的正常胃粘膜各30例,收集同期肿瘤外科术后大体标本,早期胃癌及进展期胃癌各30例,饱和氯化钠法提取组织DNA,PCR-SSCP变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染法检测PTEN杂合性缺失(LOH),PCR-SSCP测序法检测PTEN基因突变.结果:在胃癌癌前期病变萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生中,PTEN的杂合性缺失率分别为10%、10%、13.3%,在早期胃癌中,PTEN的杂合性缺失率为20%,进展期胃癌中PTEN的杂合性缺失率为33.3%,而PTEN基因突变在癌前期病变及早期胃癌中无1例出现,在进展期胃癌中出现比率为10%,而且所有发生PTEN基因突变的病例均为LOH阳性病例.结论:PTEN基因缺失或失活与胃癌的浸润和转移的关系更密切.     

胃癌中DNA 聚合酶β的突变及与幽门螺杆菌感染的关系

目的:研究胃癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况及与幽门螺杆菌感染的关系。方法:提取总RNA反转录合成cDNA,经PCR扩增后以SSCP检测其变异情况。用PCR方法检测胃癌及癌旁组织标本中幽门螺杆菌的感染情况。结果:32例胃癌组织标本中有7例polβ-SSCP异常,突变率为21.9%;而对应的32例癌旁组织PCR-SSCP结果中未见异常。H.Pylori-DNA阳性的15例,H.Pylori-DNA阳性率为46.9%(15/32);对应癌旁组织的检测结果与胃癌组织完全一致。polβSSCP阳性的标本H.Pylori-DNA也阳性。结论:胃癌组织存在polβ基因突变;这种基因突变可能与胃癌的发生、发展相关。幽门螺杆菌的感染与胃癌组织polβ突变可能存在一定的相关关系。     

胃癌MSI、hMLH1基因甲基化及其蛋白表达研究

目的：通过研究散发性胃癌中错配修复基因hMLH1启动子区5’CpG岛甲基化及蛋白表达、微卫星不稳定性(MSI)发生的情况及各指标之间的关系，探讨hMLH1基因、MSI在胃癌发生过程中的作用，揭示胃癌发生的分子机制。方法：取标本55例，其中胃癌41例，正常组织(包括正常及浅表性胃炎)14例。酚／氯仿法提取DNA，PCR扩增一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染法检测BAT-26、D2S123两个位点的MSI，酶切产物特异性扩增法检测hMLH1基因启动子区5’CpG岛甲基化异常情况，免疫组化SP法检测hMLH1蛋白的表达。结果：胃癌组MSI发生率为51.2％(21／41)，显著高于正常组(P(0．05)胃癌组hMLH1基因启动子区5’CpG岛甲基化发生率为41．5％，其中88．5％表现为蛋白表达缺失或降低，正常组织中未发现甲基化。胃癌组MSI( )中，甲基化发生率81．0％。结论：hMLH1基因甲基化是导致胃癌组织出现MSI的重要因素，MSI在散发性胃癌发生、发展过程中发挥一定作用。由于错配修复基因甲基化而丧失修复功能，引起MSI的产生，促进肿瘤的发生。对胃癌组织中hMLH1基因、MSI的深入研究，可以为肿瘤早期发现、早期诊断提供信息。     

人胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变的研究

目的研究胃癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法利用RT-PCR、SSCP和序列分析对32例胃癌及癌旁组织标本中polβ基因进行检测。结果32例胃癌组织标本中有7例SSCP异常,突变率为21.9%;而对应的32例癌旁组织PCR-SSCP结果中未见异常。在低分化胃癌中的突变率高达50.0%(6/12),而在中、高度分化胃癌中的突变率却仅为5.0%(1/20),经统计学分析,差异有显著性(P<0.05)。测序分析了7例SSCP异常中的3例,其突变分别为196位A→G,268位A→G,790位A→T;测序分析了1例PCR-SSCP无异常的癌旁组织标本,其序列无突变。结论胃癌组织存在polβ基因突变;该基因突变可能与胃癌的发生、发展相关。     

肾透明细胞癌VHL基因突变与Cyclin D1过度表达的相关性

背景与目的:VHL基因突变与肾透明细胞癌发生关系密切,而CyclinD1基因通过促进细胞过度增殖,对肾透明细胞癌发生和发展起重要作用。本研究拟初步探讨肾透明细胞癌中VHL基因突变的状况及其与CyclinD1表达上升的相关性。方法:取50例肾透明细胞癌手术标本,抽提病变组织和癌周正常组织中的基因组DNA和总RNA。通过PCR扩增VHL基因各外显子序列并测序以及内切酶鉴定的方法,确定肿瘤组织中VHL基因突变的比率和具体位点。通过RT-PCR和Westernblot方法,检测相应肿瘤组织中CyclinD1的表达水平是否发生改变。结果:VHL基因序列检测结果表明,有42例(84.0%)肾透明细胞癌标本的VHL基因发生各种形式的突变,有12(24.0%)例甚至发生2种以上的基因突变。在57例VHL基因外显子突变中,1号外显子突变有17例(29.8%);2号外显子突变有26例(45.6%);3号外显子突变有14例(24.6%)。CyclinD1的表达水平在42例VHL基因发生突变的组织中均有不同程度的上升,达到正常对照组的2～10倍(3.91±1.54倍)(P<0.01),另8例表现为正常。结论:在肾透明细胞癌中存在各种VHL基因突变,导致CyclinD1过度表达。     

mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ突变与胃癌相关性的研究

目的检测胃癌患者线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶-Ⅱ突变情况,探讨mtDNA基因突变与胃癌发生的关系及其作用机制。方法采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对50例胃癌患者癌组织细胞色素氧化酶-Ⅱ扩增并测序,检测突变情况。结果 50例胃癌患者中共有13例患者mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ检测到突变,突变率为26%,类型以点突变G→A为主。在13例突变的胃癌组织中共有10个细胞色素氧化酶-Ⅱ发生了突变,其中引起编码氨基酸改变的突变有3个。结论mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ突变与胃癌发生发展有相关性。     

肾癌微卫星不稳定性及其机制的研究

目的 探讨微卫星不稳定性（microsatelite instablility,MSI)在肾细胞癌中的表现及与基因突变的关系。方法 用PCR方法分析34例肾细胞癌MSI表现;应用RT－PCR方法检测5种人类错配修复（mismatch repair,MMR)基因在肾细胞癌和肾癌细胞系mRNA转录水平的表达;用PCR－SSCP技术对15例肾细胞癌标本进行MMR基因hMLH1的19个外显子进行筛选,观察基因突变的情况;用PCR方法检查肾癌组织中TGF－βⅡ型受体（TGF－βRⅡ）基因和BAX基因移码突变的情况。结果 34例肾细胞癌中有15例（44．1％）表现为MSI,并多见于晚期肿瘤;15例表达MSI阳性肾癌标本中,3例hMLH1基因mRNA表达缺失,3例表达明显降低,但在正常对照及PCC949细胞系都表达5种MMR基因;PCR－SSCP筛检结果,15例MSI（＋）细胞中3例显示异常电泳带型;40％（6／15）及27％（4／15）分别见TGF－βRⅡ基因及BAX基因移码突变,但不表现在MSI（－）肾肿瘤及正常细胞中。结论 肾细胞癌MSI与MMR基因表达有关,较高的突变率在肿瘤发生中的作用与MSI有关。     

胃癌中p16基因缺失与突变的研究

目的：探讨p16基因外显子2的缺失和突变与胃癌发生发展的关系.方法：应用新鲜组织标本基因组DNA抽提、PCR-SSCP分析的方法,对30例胃癌及癌旁组织中p16基因外显子2的缺失和突变进行检测.结果：胃癌组织样本中p16基因外显子2的缺失率为10.00%,突变率为10.00%,两者之和为20.00%,癌旁组织样本中未发现缺失和突变,统计学分析有显著性差异（P〈0.01）.结论：p16基因外显子2的缺失和突变与胃癌的发生具有一定的相关性.     

上消化道恶性肿瘤中p16基因突变的研究

目的　研究p16基因突变与食管癌和胃癌发生的关系。方法　采用PCR、多重PCR、PCR SSCP和DNA测序等技术分析了 2 5例食管癌和 40例胃癌组织标本。结果　 1.食管癌中p16基因突变频率为 16 % ,并且突变频率与肿瘤的大小、位置、分化程度和有无淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。 2 .胃癌中p16基因突变频率为 7.5 % ,并且突变与肿瘤的大小、位置、分化程度和有无淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论　 1.P16基因点突变可能是食管癌和胃癌发生发展过程中的影响因素之一 ,错义突变是其失活的主要原因。 2 .P16基因点突变的检测对食管癌和胃癌早期诊断有一定帮助。     

改良的内切酶突变体富集法检测肺癌标本中EGFR基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是肺癌靶向药物疗效的可靠预测指标,因此基因突变的检测具有非常重要的临床意义。本研究建立使用常规实验仪器、高灵敏度、简便的检测表皮生长因子受体突变的方法,以利于临床中快速的检测EGFR基因突变。方法采用改良的内切酶法富集法检测251例肺腺癌DNA标本中EGFR基因外显子19缺失突变和21(L858R)点突变,并与直接测序进行比较。利用混合突变/野生型EGFR基因的细胞系测定改良方法的灵敏度。结果在251例腺癌标本DNA中使用测序法检测出EGFR外显子19突变46例、外显子21突变26例。采用改良的突变体富集法检另外测出外显子19突变78例、外显子21突变57例,总突变率53.8%。灵敏度检测显示对于外显子19和21,新方法的检测灵敏度达0.5%。结论本方法具有简便、经济、灵敏度高等特点,便于临床快速筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。     

胃黏膜癌前病变和胃癌组织相关癌基因和抑癌基因表达差异的研究

目的:探讨胃黏膜癌前病变与胃癌组织中Bcl-2、Bax、p16和p53蛋白的表达和意义。方法:用免疫组化法检测Bcl-2、Bax、p16和p53产物在79例胃癌、23例胃黏膜不典型增生和21例肠上皮化生组织中的表达。结果:Bcl-2在胃癌和不典型增生组织中的阳性率分别为73.4%(58/79)和78.2%(18/23),差异无统计学意义,P=0.273;但是显著高于肠上皮化生组织(38.1%,8/21),P<0.01。Bax、p16和p53在胃癌和不典型增生及肠上皮化生组织中的阳性率分别为41.8%(31/79)、69.6%(18/23)、80.9%(17/21)和45.6%(36/79)、65.2%(15/23)、76.1%(16/21)及82.3%(65/79)、39.1%(9/23)、28.6%(6/21),差异有统计学意义,P<0.01。结论:Bcl-2对胃黏膜细胞凋亡有明显的负性调节作用,而抑癌基因Bax表达对Bcl-2的抑制凋亡功能有对抗调节作用;p16基因直接参与细胞生长增殖的负调节,突变的p53基因通过抑制细胞凋亡而参与胃癌的发生。     

非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变循环DNA检测

目的:探讨循环DNA测定表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变的可行性;旨在提供更方便、快捷、无创的分子生物检测手段,指导晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者靶向治疗。方法:收集石河子大学医学院第一附属医院2011-09-21-2012-09-30接受靶向治疗(吉非替尼或厄洛替尼)的48例晚期NSCLC患者血清及相应石蜡组织标本DNA,采用直接测序法检测EGFR基因19和21外显子的突变情况,应用SPSS17.0软件进行统计学分析。结果:48例患者循环DNA中EGFR基因突变检出率为14.583%(7/48),且与组织DNA检测出EGFR突变类型一致,即19外显子突变型为19DelK746~A750、19DelK745~E749和19DelK745~A750;21外显子突变类型分别为21L858R和21L861Q。EGFR突变主要发生在女性及不吸烟的患者中;且EGFR基因突变型者PFS明显优于野生型患者,χ2=11.287,P=0.001。以组织DNA检测为准,循环DNA中EGFR基因突变检测的特异性为97%,并且与组织DNA检测EGFR基因突变具有一定的一致性,Kappa=0.433。结论:血清循环DNA可用于EGFR基因突变检测,为肺癌靶向治疗提供实验依据。     

41例人脑胶质瘤组织中p53基因突变的研究

背景与目的:p53抑癌基因在细胞周期的调控、维持细胞基因组的完整性、诱导细胞分化和凋亡中起着重要作用。胶质瘤尤其是星形细胞肿瘤中,经常发生p53基因突变。本研究探讨人脑胶质瘤中p53突变及与胶质瘤发生发展的相关性。方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chainreaction-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)及DNA测序技术对41例不同类型人脑胶质瘤p53基因突变进行检测。结果:通过PCR-SSCP检测发现在41例人脑胶质瘤组织中有17例(41.5%)呈现p53基因的单链构象多态性改变,均位于5～8外显子,突变例数依次为7(41.2%)、1(5.9%)、4(23.5%)、5(29.4%)。Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中p53基因突变率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤(58.3%vs.17.6%,P<0.01);DNA序列分析显示,17例PCR-SSCP检测阳性的肿瘤p53基因相应外显子均存在基因点突变或缺失,其中错义突变13例,占76.5%;同义突变2例,占11.8%;移码突变2例,占11.8%;碱基突变以G→A或A→G最多,占55.6%。结论:胶质瘤中p53突变多发生于第5、8外显子,基因突变类型以错义突变为主,该基因的突变与胶质瘤的发生及恶性进展过程相关。     

胃癌组织和腹腔冲洗液p53基因突变的DHPLC技术检测

目的:应用部分变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)检测胃癌组织、腹腔冲洗液中p53基因突变,并探讨该技术成为检测胃癌腹膜亚临床转移理想方法的可能性.方法: 应用DHPLC对45例胃癌组织及腹腔冲洗液中p53基因突变进行检测,并测序验证.结果:胃癌组织p53基因的突变率为20 0%(9/45),9例突变中有3例突变均未见报道;p53基因在肠型胃癌中突变率35 3%(6/17)明显高于弥漫型胃癌10 7 %(3/28),P＜0 01.腹腔冲洗液中检出p53基因突变2例,检出率为22 2%(2/9),经测序证实分别位于第5 外显子(AAG>AGG,Lys132Arg) 和第6外显子(CTG>CCG,Leu188Pro),均与原发癌组织中相同,这2例患者腹腔冲洗液细胞学检测均为阴性.结论:DHPLC可应用于胃癌患者原发癌灶及腹腔冲洗液中p53基因突变的检测,而且如有效地联合检测多个指标,则可能成为预测胃癌腹膜亚临床转移的理想方法.     

晚期胃癌患者血液ctDNA水平与组织学基因检测的一致性比较

目的:比较晚期胃癌患者外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）与组织学基因检测的一致性,讨论ctDNA的临床应用价值。方法:根据纳排标准最终收集30例晚期初诊初治胃癌患者的实体组织标本及血浆标本,并用二代测序(next generationg sequencing,NGS)技术分别检测68个基因在其中的表达状况。对比ctDNA与组织学检测基因的检出一致性及差异,评估其用于诊断胃癌的敏感度、特异度。并按胃癌突变基因分层进一步评估ctDNA的检出率。结果:30例患者中检出的基因突变总共138个,其中组织学标本中总共检出71个,ctDNA中总共检出67个。ctDNA对比组织学检测基因诊断胃癌的灵敏度为31.5%,特异度为63.6%,一致率为43.3%。单基因检测分析突变最多的基因前三位为TP53、PIK3CA、HER-2。其中对PIK3CA的检测,组织学和ctDNA两种方法差异有统计学意义（P＜0.05）。TP53、PIK3CA、HER-2、EGFR、KRAS在组织学中检出丰度大于1,但在ctDNA中小于1。有PIK3CA突变的患者中,共存的其他致癌基因突变位点包括KRAS 2例、BRAF 2例、EGFR 4例。有HER-2突变的患者中,共存PIK3CA突变者4例,共存KRAS突变者3例。结论:ctDNA检测虽然在晚期胃癌患者的诊断中敏感度、特异度低于组织标本基因检测,但其标本易获、接受度高,可作为基因检测的补充、备选。实体组织检出相同基因的突变丰度总体高于ctDNA。TP53、PIK3CA、HER-2、EGFR等基因在ctDNA中的检出有利于指导胃癌治疗及预后评估,尤其PIK3CA在ctDNA中高于组织中的检出率。ctDNA检测可为胃癌患者的精准靶向治疗提供依据。     

肺癌外周血EGFR突变检测及其临床意义

目的:通过血浆循环DNA的基因突变检测,筛选表皮生长因子受体(E-GFR)突变型肺癌患者,探讨突变特征及其在肺癌靶向治疗中的意义.方法:选取2009年9月至2010年5月苏州大学附属第一医院及上海市三甲类医院收治的96例肺癌患者的血浆以及其中59例相对应的肿瘤组织中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序的方法检测EGFR基因的突变.结果:96例肺癌血样中检测出EGFR突变17例,其突变率为17.7%.在这些突变的样本中,外显子19和21突变分别占88.2%(15/17)和11.8%(2/17),其中直接测序法检测出EGFR纯合突变3例[L858R 2例,del E746-A750(1)1例],杂合突变14例.对14例杂合突变样本进一步通过单克隆基因测序法确定其突变类型为del E746-A750(2)9例、del E746-A750(1)3例、del L747-S752 2例.EGFR基因突变多见于肺腺癌(包括腺鳞癌)患者,与患者的性别与吸烟史无明显相关性.59例肺癌患者肿瘤组织的进一步分析证明,血浆EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同,表明血浆DNA检测到的EGFR突变与原发肿瘤检测到的突变相一致.结论:肺癌患者的血浆循环DNA与相对应的肿瘤组织DNA的EGFR基因突变类型一致;此外,相对于传统的"金标准"直接测序法而言,单克隆基因测序的方法能够更精确地判断基因的突变类型.这种简便且微创地检测血浆循环DNA的方法可应用于肺癌EG.FR基因突变的诊断,从而预测靶向治疗的疗效.     

散发性微卫星不稳定性结直肠癌患者Mt-p53、bcl-2、hMLH1和hMSH2蛋白表达及意义

目的探讨散发性微卫星不稳定性结直肠癌患者突变型P53基因(Mt-p53)、B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、人类错配修复基因1(hMLH1)和人类错配修复基因2(hMSH2)蛋白表达及临床意义。方法选取2017年10月至2018年11月间山东大学齐鲁医院收治的149例经手术切除的散发性结直肠癌(SRC)标本作为肠癌组,另收集距癌组织边缘10cm处的健康肠组织标本149例为健康组。采用PCR仪及遗传分析仪对肠癌组标本进行微卫星不稳定(MSI)检测,采用免疫组化检测试剂盒检测两组标本Mt-p53、bcl-2、hMLH1和hMSH2蛋白表达情况。结果 149例SRC标本中,位点D2S123 MSI阳性率为12. 1%,位点BAT26MSI阳性率为18. 1%,位点D17S261 MSI阳性率为10. 1%,位点D17S799 MSI阳性率为8. 1%。其中MSI-L为18例,MSI-H为22例,MSI总阳性率为26. 8%。149例肠癌组中Mt-p53蛋白表达阳性率为67. 1%(100例),bcl-2蛋白表达阳性率为77. 9%(116例),hMLH1蛋白表达阳性率为73. 2%(109例),hMSH2蛋白表达阳性率为71. 1%(106例)。149例健康组中Mt-p53、bcl-2、hMLH1和hMSH2蛋白表达阳性率均为100. 0%(149例)。两组标本各蛋白表达情况比较,差异均有统计学意义(均P <0. 01)。MSI阳性标本及阴性标本中Mt-p53、bcl-2和hMSH2蛋白表达阳性率比较,差异均无统计学意义(均P> 0. 05)。MSI阳性标本及阴性标本中hMLH1蛋白表达阳性率比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 SRC的发生不仅与Mt-p53的失活和bcl-2的激活有关,还与错配修复(MMR)基因突变引发的MSI相关,是SRC新的重要发生机制。MSI与Mt-p53、bcl-2和hMSH2蛋白表达情况相关性不大,但部分MSI与hMLH1蛋白表达显著相关,其余MSI可能涉及其他MMR基因。     

特异引物双扩增实时PCR法和Sanger DNA测序法检测肺癌组织中表皮生长因子受体基因突变

目的 探讨特异引物双环探针扩增实时PCR技术表皮生长因子受体(EGFR)检测方法(ADx-EGFR实时PCR法)和Sanger DNA测序法在肺癌EGFR基因体细胞突变检测中的临床价值.方法 收集肺癌组织石蜡切片208例,分别采用ADx-EGFR实时PCR法和Sanger DNA测序法检测肺癌组织中EGFR基因外显子18、19、20、21的突变类型,计算其突变率,分析两种检测方法检测EGFR基因突变的一致性.结果 208例肺癌组织中,ADx-EGFR实时PCR法成功检测208例,检出EGFR基因突变40例,突变检出率为19.2％;Sanger DNA测序法成功检测196例,检出突变22例,突变检出率为11.2％.肺癌组织中主要以外显子19缺失和外显子21上的L858R的点突变为主,分别占4.8％ (10/208)和11.6％ (23/208),其余的突变类型少见.结论 对于甲醛固定石蜡包埋组织而言,ADx-EGFR实时PCR法检测EGFR基因成功率和突变检出率均高于Sanger DNA测序法,可成为临床上检测肿瘤EGFR基因突变的方法.