动物水平的绿原酸通过Notch1信号通路调控非小细胞肺癌凋亡及机制研究

背景与目的 绿原酸类物质可通过调节细胞周期、诱导凋亡、抑制细胞生长等途径产生抗癌作用,Notch信号通路与人类许多肿瘤都存在密切的关系,本研究旨在探讨绿原酸通过Notch1信号通路控制非小细胞肺癌细胞凋亡的作用机制,为临床应用以及Notch1靶向药物的研究提供依据.方法 MTT法检测不同浓度的绿原酸对非小细胞肺癌细胞系A549细胞形态和细胞增殖的影响;流式细胞仪检测绿原酸对A549细胞的凋亡和细胞周期的影响;建立A549细胞的裸鼠荷瘤模型;测量肿瘤大小和重量;实时荧光定量PCR法检测Notch信号通路相关因子的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Notch信号通路相关因子的蛋白表达水平.结果 绿原酸抑制A549细胞增殖,诱导A549细胞凋亡,增加细胞G2期/M期细胞百分比增加(P<0.05),并且呈现剂量依赖趋势.在A549细胞的裸鼠荷瘤模型中,实验组肿瘤大小和体积明显小于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).试验组Notch1、VEGF、Delta4、HES1、HEY1 mRNA表达量较对照组明显减少(P<0.05).实验组Notch1蛋白明显减少,PTEN、p-PTEN、p-AKT明显增加(P<0.05).结论 在动物水平,绿原酸可能通过Notch1信号通路调控非小细胞肺癌的凋亡,可能是通过减少VEGF的表达,下调Delta 4水平,从而抑制Notch1信号通路的活化.Notch1信号通路可能通过PTEN与PI3K/AKT通路存在交叉调控作用.     

槲皮素对肺癌干细胞活性的影响

目的 探索槲皮素对 A549 肺癌干细胞活性及对 Wnt / β-连环蛋白(β-catenin)和音猬因子( sonic hedgehog,SHH)信 号通路的影响。 方法 使用不同浓度槲皮素(0、5、10、25、50、100 和 200 μmol / L)处理肺癌 A549 细胞 24、48 和 72 h,MTT 法检 测细胞存活率。 采用无血清培养法分离富集肺癌干细胞,观察槲皮素对 A549 悬浮细胞球体积、数量以及肺癌干细胞分子标 志物表达的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法检测增殖凋亡相关指标以及 Wnt / β-catenin 和 SHH 信号通路关键 分子的表达变化。 结果 槲皮素能够显著抑制 A549 细胞活力,且呈现时间和浓度依赖性;与空白对照组相比,槲皮素均显著抑 制 A549 成球能力和肺癌干细胞分子标志物[CD133、CD44 和醛脱氢酶 1A1(ALDH1A1)]表达;同时,肺癌干细胞增殖相关蛋 白增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)和 B 细胞白血病/ 淋巴瘤-2(Bcl2)水平显著下调,凋亡相关指标 Bcl2 相关蛋白 X(Bax)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cleaved Caspase 3)表达显著上调;槲皮素处理后,肺癌干细胞中 Wnt / β-catenin 和 SHH 信号通路关键分子磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK3β)( Ser9)、β-catenin、原癌基因蛋白 c-Myc、胶 质瘤相关癌基因同源物 1(GLi1)、GLi2 和 SHH 的蛋白水平明显下降。 结论 槲皮素显著抑制肺癌干细胞活性,其机制可能与 调控 Wnt / β-catenin 和 SHH 通路有关。     

抑制Notch和PI3K/Akt信号通路对食管腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的 探讨Notch和PI3K/Akt两条信号通路对人食管腺癌细胞OE33增殖、侵袭及迁移能力的影响及两条信号通路之间的联系。方法 应用Notch信号通路阻滞剂DAPT和PI3K/Akt信号通路阻滞剂LY294002分别单独和联合处理OE33细胞,设置对照组;Western blot和实时定量PCR法检测OE33细胞中NICD、Hes1、p-Akt、PTEN蛋白和mRNA的表达变化;CCK-8法检测细胞的增殖抑制率;划痕实验用于检测细胞迁移能力的变化;Transwell细胞侵袭实验用于检测细胞的侵袭能力变化。结果 Notch1通路阻滞剂DAPT能减低Notch1通路相关蛋白NICD和Hes1的表达,并能提高p-Akt蛋白的表达;PI3K/Akt路阻滞剂LY294002不仅使p-Akt的蛋白表达水平减低,还能降低Hes1的蛋白表达水平,同时使NICD的蛋白和Hes1的mRNA表达水平增高。DAPT和LY294002联合处理组的NICD、Hes1、p-Akt的蛋白表达均较空白对照组和单药处理组降低,同时细胞的增殖、迁移和转移能力亦明显减弱。各处理组中PTEN的蛋白和mRNA表达水平较对照组均有一定程度的升高。结论 Notch和PI3K/Akt两条信号通路在食管腺癌细胞OE33中可能存在串话, 同时抑制这两种信号通路能有效的抑制OE33的增殖、侵袭及迁移。     

LncRNA-p21调控Notch信号通路对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的 探讨LncRNA-p21调控Notch信号通路对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响。方法 pcDNA-lincRNA-p21、空载质粒pcDNA转染A549细胞设为过表达组和空载组;稳定转染过表达组加入Notch信号通路特异性激活剂Jagged1蛋白,设为Notch激活剂组;不作处理细胞为对照组。MTT法、划痕实验和Transwell小室实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭情况。RT-qPCR及Western blot法检测各组Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达。结果 过表达组培养24、48和72 h MTT实验A值均低于对照组、空载组和Notch激活剂组,Notch激活剂组低于对照组和空载组（P<0.05）;过表达组48 h细胞迁移率和穿膜细胞数及Notch1、HES-1、NICD、Vimentin mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组、空载组和Notch激活剂组,Notch激活剂组低于对照组和空载组（P<0.05）;过表达组E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量高于对照组和Notch激活剂组,Notch激活剂组高于空载组和对照组（P<0.05）。结论 LncRNA-p21基因过表达可抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭,其调控机制可能与抑制Notch信号通路、阻断A549细胞上皮间质转化有关。     

乳腺癌细胞条件培养基对成骨细胞增殖抑制作用的机制探讨

目的:探讨MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对hFOB1.19成骨细胞的增殖抑制作用与Notch信号通路的相关性。方法:MTT法检测MDA-MB-231、MCF-7乳腺癌细胞条件培养基对hFOB1.19细胞的增殖抑制效果;Western Blot与qRT-PCR分别检测hFOB1.19细胞的Notch1、Jagged1、Hes1蛋白与mRNA的表达。结果:MDA-MB-231、MCF-7条件培养基抑制hFOB1.19细胞增殖,DAPT（Notch阻断剂）可明显降低MDA-MB-231、MCF-7条件培养基对hFOB1.19细胞增殖的抑制作用。MDA-MB-231、MCF-7条件培养基上调hFOB1.19细胞Notch1、Jagged1、Hes1的mRNA和蛋白的表达,并随着条件培养基浓度的增加,以上指标的表达呈先上升而后下降的趋势。Notch阻断剂DAPT明显抑制两细胞条件培养基对hFOB1.19细胞的Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA和蛋白表达的上调作用。结论:MDA-MB-231、MCF-7条件培养基对hFOB1.19细胞增殖抑制作用的机制与Notch信号通路相关。     

姜黄素对肝癌细胞凋亡及TNF-ɑ、IL-1β、IL-6炎性因子影响的机制研究

目的 探讨姜黄素对肝癌细胞凋亡及肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)、白介素1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)炎性因子的影响及机制.方法 采用5、10、20、40、80、160μmol/L的姜黄素处理人肝癌HepG2细胞24、48 h后,CCK8实验检测细胞的增殖情况,计算IC50值;50μmol/L的姜黄素处理HepG2细胞48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot检测TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Notch1、Hes1蛋白表达情况.结果 细胞抑制率随着姜黄素作用时间及浓度的增加显著升高.根据IC50值选择50μmol/L的姜黄素作为研究对象;以50μmol/L的姜黄素处理肝癌细胞的凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达明显高于对照组,TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、Notch1、Hes1蛋白表达均明显低于对照组(P﹤0.01).结论 姜黄素可呈时间及剂量依赖式抑制人肝癌HepG2细胞增殖,可诱导细胞的凋亡,可通过降低TNF-ɑ、IL-1β、IL-6的表达达到抗炎作用,其机制与抑制Notch1信号通路有关.     

Notch1信号通路调控乳腺癌肿瘤细胞放疗敏感性的机制研究

摘　要：［目的］ 探讨抑制Notch1信号通路对乳腺癌肿瘤细胞放疗敏感性的影响及机制。［方法］ Western blot检测人乳腺癌MCF-7细胞中加入5、10、20μmol/L的Notch1信号通路抑制剂γ分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitor,GSI)后Notch1、Hes1蛋白表达;克隆形成实验检测细胞经GSI和照射处理后增殖情况;后续实验分为对照组、GSI组和GSI+8Gy组,48h后CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Ki67、Cleaved caspase3蛋白表达。［结果］ 随着GSI的浓度增高,Notch1和Hes1蛋白表达随之降低(P<0.05),且呈剂量依赖性关系。GSI与照射同时处理细胞较单纯用照射有较高的增敏比。GSI组和GSI+8Gy组细胞吸光值均显著性低于对照组(P<0.05),而GSI+8Gy组吸光值显著性低于GSI组(P<0.05),除对照组,GSI组和GSI+8Gy组随着处理时间的延长均明显降低(P<0.05),呈时间依赖性关系。GSI组和GSI+8Gy组细胞凋亡率均显著性高于对照组,GSI+8Gy组细胞凋亡率显著性高于GSI组(P<0.01)。GSI组和GSI+8Gy组Ki67蛋白表达显著性低于对照组(P<0.05),Cleaved caspase3蛋白表达显著性高于对照组(P<0.05),GSI+8Gy组Ki67蛋白表达显著性低于GSI组,Cleaved caspase3蛋白表达显著性高于GSI组(P<0.05)。［结论］ 抑制Notch1信号通路可增强乳腺癌的放疗敏感性。     

Notch信号阻断剂抑制鼻咽癌细胞增殖的作用及机制

目的探讨Notch信号阻断剂抑制鼻咽癌细胞增殖的作用及其机制。方法应用Notch信号特异性抑制剂GSI抑制Notch信号的表达,MTT法检测癌细胞的生长增殖变化;流式细胞及Hoechst 33258染色检测癌细胞凋亡;应用Western blot检测Notch信号受抑制后AKT、MEK信号通路的变化。结果应用Notch抑制剂GSI作用后,癌细胞Notch1、2、4表达明显下降,而Notch3无明显变化。GSI作用后癌细胞增殖明显受到抑制,凋亡增加;该作用有浓度及时间双重依赖性（P<0.05）。Notch信号阻断后磷酸化AKT、GSK3β和ERK1/2显著下降,而总AKT、总GSK3β及总ERK1/2无明显变化。结论阻断鼻咽癌细胞Notch信号可以显著抑制鼻咽癌细胞增殖及诱导癌细胞凋亡。该作用可能与下调AKT及MEK信号通路有关。     

肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞的生物学功能研究

探讨肺癌A549细胞株中具有肿瘤干细胞特性的ALDH1+细胞的生物学功能特性。方法:运用流式细胞仪分选肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞,并通过肿瘤球培养、MTT实验、平板克隆、Transwell小室迁移实验、裸鼠体内成瘤实验来验证ALDH1+细胞的自我更新、增殖克隆、迁移及致瘤能力。结果:ALDH1+ A549细胞的肿瘤球形成能力、增殖克隆、迁移和体内成瘤能力明显高于ALDH1- A549细胞和未经分选的A549细胞。结论:A549细胞株中ALDH1+ A549细胞具有自我更新、增殖、迁移和高致瘤能力的肿瘤干细胞特性,ALDH1可作为分选肺癌肿瘤干细胞的标志物。      

长链非编码RNA LIMT调控TGF-β信号通路对肺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:检测lncRNA LIMT在肺癌组织中的表达水平，探讨lncRNA LIMT表达对肺癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能的分子作用机制。方法:利用荧光定量PCR（RT-qPCR）检测lncRNA LIMT在肺癌组织中的表达水平；在肺癌细胞A549中转染lncRNA LIMT过表达质粒pEGFP-C1-LIMT及敲减lncRNA LIMT的特异性siRNA-LIMT及其相关对照，RT-qPCR验证其转染效率；利用CCK-8法、流式细胞术检测转染lncRNA LIMT过表达质粒及siRNA-LIMT后肺癌细胞的增殖及凋亡能力变化；利用Western blotting检测TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β1蛋白及Smad4蛋白的表达水平。结果:RT-qPCR结果显示:肺癌组织中lncRNA LIMT的表达水平显著低于配对癌旁组织（P＜0.05）；细胞转染实验结果显示:转染pEGFP-C1-LIMT后A549细胞中lncRNA LIMT的表达水平显著高于转染空载质粒（P＜0.001），转染siRNA-LIMT后A549细胞中lncRNA LIMT的表达水平显著低于转染对照siRNA-NC（P＜0.01）；CCK-8和流式细胞术实验结果显示:过表达lncRNA LIMT显著抑制了肺癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡（P＜0.01），敲减lncRNA LIMT显著促进了细胞增殖、抑制细胞凋亡（P＜0.01）；Western blotting结果显示:lncRNA LIMT过表达的肺癌细胞中TGF-β1蛋白表达水平显著降低，Samd4蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），敲减lncRNA LIMT的肺癌细胞中TGF-β1蛋白表达显著升高，Samd4蛋白表达显著降低（P＜0.05）。结论:lncRNA LIMT在肺癌组织中表达下调，过表达lncRNA LIMT抑制肺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，敲减lncRNA LIMT促进肺癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，可能通过对TGF-β信号通路的调控来实现。     

姜黄素联合KLF8-siRNA干扰对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制

目的:探讨姜黄素联合KLF8-siRNA干扰对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制.方法:采用脂质体法将KLF8-siRNA干扰序列转染至体外培养的A549细胞中,RT-PCR和Western blot检测转染效果.实验分为NC组(转染阴性对照)、KLF8-siRNA组(转染KLF8-siRNA)、Cur组(...     

低表达DJ-1调控PI3K/AKT通路对肺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨低表达DJ-1对肺癌细胞增殖凋亡及PI3K/AKT通路的影响。方法:采用Western blot检测肺癌细胞系中DJ-1蛋白的表达;以脂质体法转染干扰SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的表达后,MTT法检测细胞的增殖变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Western blot检测细胞中p-AKT和AKT蛋白的表达水平;将PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理SK-MES-1细胞48 h后,MTT法和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡情况,Western blot检测细胞中p-AKT和AKT蛋白的表达。结果:与正常肺上皮BEAS-2B细胞相比,肺腺癌A549细胞和肺鳞癌SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的相对表达量均显著升高,且SK-MES-1细胞中DJ-1蛋白的表达量高于A549细胞,差异均有统计学意义（P＜0.05）。转染后siRNA DJ-1组细胞中DJ-1蛋白的表达量明显低于对照组（P＜0.05）;与对照组相比,转染24 h后siRNA DJ-1组细胞的吸光值（OD值）变化不显著（P＞0.05）,而转染48 h和72 h后细胞的OD值明显降低（P＜0.05）;转染48 h后,与对照组相比,siRNA DJ-1组细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）,p-AKT/AKT值显著降低（P＜0.05）。SK-MES-1细胞经抑制剂LY294002处理48 h后,细胞的增殖凋亡趋势与下调DJ-1表达的结果相一致。结论:DJ-1在肺癌细胞中高表达,下调其表达能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

Numb蛋白及Numb/Notch信号通路对人胰腺癌细胞株放疗敏感性的影响

目的 探讨Numb蛋白及其Numb/Notch信号通路对人胰腺癌细胞株放疗敏感性的影响.方法 人胰腺癌细胞MIA PaCa-2经辐射处理.MTT法检测各组细胞生长活力;流式细胞术检测各组细胞总凋亡率.细胞划痕实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力.Western blot方法检测Numb/Notch信号通路Numb蛋白及下游分子Notch1、Hes1和Hes5的mRNA和蛋白表达.结果 MTT实验显示随着辐射剂量的增加,MIA Pa-Ca-2细胞吸光度值均低于未受辐射细胞的吸光度值(P﹤0.05).细胞凋亡实验显示随着辐射剂量的增加,MIA PaCa-2细胞总凋亡率均高于未受辐射细胞的总凋亡率(P﹤0.05).细胞划痕实验和Transwell实验显示随着辐射剂量的增加,MIA PaCa-2细胞的迁移和侵袭能力减弱,其在1、3、5 Gy的放射剂量下迁移侵袭能力低于未受辐射细胞(P﹤0.05).qRT-PCR和Western blot方法检测显示,细胞随着辐射剂量的增加,Numb的mRNA和蛋白表达量增加,Notch1、Hes1和Hes5的mRNA和蛋白表达量较未受辐射的细胞的表达量降低(P﹤0.05).结论 Numb蛋白表达增高,Numb/Notch信号通路在胰腺癌细胞中呈激活状态,Numb/Notch信号通路在胰腺癌细胞中的强弱与X射线放射剂量的大小有关.     

川芎嗪通过调控Wnt信号通路抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的:探讨川芎嗪通过调控Wnt信号通路影响人肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究。方法:将培养的人肺癌细胞A549随机分为四组:对照组、川芎嗪组、抑制剂组、川芎嗪+抑制剂组,噻唑蓝（MTT）法检测各组A549细胞增殖能力,流式细胞术检测各组A549细胞生长周期,Transwell实验检测各组A549细胞侵袭能力,划痕实验检测各组A549细胞迁移能力,蛋白免疫印迹（Western blot）检测各组A549细胞中β-连环蛋白（β-catenin）、c-myc、增殖细胞核抗原（PCNA）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白水平。结果:与对照组相比,川芎嗪组和抑制剂组均能够抑制A549细胞增殖,阻滞细胞周期至G1期,阻碍细胞侵袭和迁移,下调细胞中β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-9蛋白水平,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与川芎嗪组和抑制剂组相比,川芎嗪+抑制剂组A549细胞增殖能力显著降低,细胞周期阻滞于G1期,细胞侵袭和迁移能力受到抑制,细胞中β-catenin、c-myc、PCNA和MMP-9蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:川芎嗪能够抑制人肺癌细胞A549细胞的增殖、侵袭和迁移,其作用机制与抑制Wnt信号通路的激活有关。