抗人类癌抗原单克隆抗体的制备与肝组织中的鉴定

目的运用杂交瘤技术制备人类癌抗原(Human carcinoma antigen,HCA)的IgG单克隆抗体。方法用现有的HCA-IgM抗体HAE3分别从PC3、PCaT及LCaT总蛋白中分离纯化得到三组糖蛋白复合物组分作为抗原分别免疫Balb/c小鼠,获得鼠抗人HCA抗体.并对这些抗体进行ELISA检测效价、western-blot以及免疫组化等分析,筛选合适的抗体进行下一部分研究。结果共制备出62株高亲和力、高特异性并且针对不同抗原结合位点的鼠抗人HCA单克隆抗体。通过在肝组织上的鉴定,发现这些抗体无论效价、western-blot以及免疫组化都适合进行进一步研究。结论我们利用天然HCA抗原制备了高亲和力,高特异性并且针对不同抗原结合位点的单克隆抗体,为我们进一步研究其结构及功能提供了有力的特异的工具。     

抗乳腺癌多形上皮黏蛋白1单克隆抗体的制备及初步应用北大核心CSCD

目的 制备并鉴定抗多形上皮黏蛋白1（MUC1）单克隆抗体,将抗体应用于人乳腺癌组织、纤维腺瘤、囊性增生症及正常乳腺组织的临床鉴别,采用免疫组化方法进行检测.方法 用合成的MUC1重复序列短肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）及牛血清白蛋白（BSA）偶联后作为抗原免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术筛选出稳定分泌单克隆抗体的细胞株.制备单克隆抗体,以ELISA、Western blot、流式细胞术、免疫荧光法对抗体进行特异性鉴定及亚类分析;将抗体应用于人乳腺癌组织、纤维腺瘤、囊性增生症及正常乳腺组织的临床鉴别,采用免疫组化方法进行检测.结果 获得4株稳定分泌抗MUC1的杂交瘤细胞株,第1株反应性最强,效价1∶10 7以上.抗体亚型3株为IgG1,1株为IgM,轻链均为κ型.经Western blot、流式细胞术、免疫荧光、免疫组化检测证实抗体与乳腺癌细胞株MCF-7特异性结合,单抗检测MUC1在乳腺癌组织与纤维腺瘤、囊性增生症及正常乳腺组织之间表达差异明显（均P＜0.01）.结论 抗MUC1单克隆抗体经检测效价高、特异性强,为乳腺癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究奠定了基础.     

抗人精子蛋白22单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:制备小鼠抗人精子蛋白SP22单克隆抗体并鉴定其特异性。方法:用BL/21菌表达的SP22作抗原免疫BALB/c小鼠,用有限稀释法筛选分泌SP22单克隆抗体(M cAb)的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,通过ELISA技术,W estern印迹方法鉴定其敏感性及特异性。免疫组化法探讨SP22在人精子表面的分布与定位。结果:获得3株稳定分泌SP22单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养液浓缩上清和混合腹水的效价分别为1∶1000和1∶3 200,抗体亲和力为1.0×107L/mol,小鼠IgG亚类均为IgG1,W estern印迹结果显示该抗体能特异性识别人精子SP22,免疫组化结果显示SP22主要定位于精子的顶体部位。结论:用杂交瘤技术制备的抗人SP22单克隆抗体具有高的效价和特异性,并且能特异地与人精子表面的SP22蛋白结合。     

SLC35 F2抗体制备与非小细胞肺癌组织中SLC35 F2蛋白表达检测

目的 制备SLC35F2多肽抗体,鉴定其性能,检测其对应蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达.方法 通过蛋白质序列分析,选4段氨基酸序列合成多肽,混合免疫家兔,制备抗SLC35F2多肽抗体,经纯化、效价检测、特异性鉴定后,将抗体用于NSCLC标本免疫组织化学染色.结果 获得兔抗人SLC35F2多肽抗体,效价1:10<"5,Western blot可特异识别41 KD的SLC35F2蛋白,免疫组织化学示细胞胞质特异性染色.129例NSCLC的组织微阵列免疫组织化学染色显示,SLC35F2蛋白表达在90.7%(117/129)肺癌标本为++到+++;而仅在17.1%(22/129)癌旁正常肺组织为++,其余为-或+;SLC35F2蛋白表达在NSCLC组织中高于癌旁正常肺组织(P<0.01);NSCLC病理分期与SLC35F2的升高表达存在低度相关(r=0.175).结论 用多肽免疫家兔制备抗SLC35F2抗体具有较高的效价和特异性,SLC35F2在NSCLC中表达高于癌旁正常组织.     

抗肝癌血管内皮细胞的单克隆抗体的制备和鉴定

目的　研究制备抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体,并进行初步的鉴定。方法　单克隆抗体制备：将制备好的抗原、免疫动物,行ＰＥＧ 细胞融合、免疫组织化学和ＥＬＩＳＡ抗体筛选,进行细胞克隆。抗体的生产及纯化;组织学鉴定分析：亲和层析蛋白分离、ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳、免疫组织化学分析;抗体的体外细胞毒作用试验选用补体介导的细胞毒实验ＭＴＴ法。结果　以经肝癌细胞系培养上清诱导扩增的人胎脐静脉血管内皮细胞为抗原,制备并获得了抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体;组织学研究表明,抗体在肝癌组织的血管内皮细胞中有特异性,在体外对诱导扩增的血管内皮细胞有补体介导的细胞毒作用。结论　制备并获得抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体;抗体在体外具有细胞毒作用。     

抗人肾癌G250单克隆抗体的制备及其功能鉴定

目的 大量制备、纯化抗人G250单克隆抗体(G250-MeAb),并鉴定其与G250合成多肽及细胞天然抗原的结合特异性.方法 将抗人G250杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠腹腔,大量制备G250-McAb.采用正辛酸-硫酸铵沉淀法获得粗制抗体,然后经蛋白A亲和层析柱纯化抗体.采用荧光激活细胞分类术及免疫组织化学法鉴定G250-McAb与抗原结合特异性.结果 成功制备抗人G250-MeAb,腹水经纯化后,获得了高纯度抗人G250单克隆抗体,蛋白浓度达4.78 g/L.荧光激活细胞分类术及免疫组织化学结果 显示G250-McAb与G250表达阳性的Ketr-3细胞特异性结合,而不与G250表达阴性的ACHN细胞结合.结论 成功制备并纯化G250-McAb,为进一步开展G250-McAb介导的肾癌诊断、治疗奠定了基础.     

抗人精子表面蛋白P34H单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定抗人精子表面蛋白P34H的单克隆抗体(M cAb)。方法:以重组P34H蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌抗P34H M cAb的细胞株,并制备腹水型M cAb,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、W estern印迹鉴定其敏感性及特异性。结果:获得1株(2C4)IgG1 Kappa型抗P34H M cAb。ELISA结果表明腹水型M cAb效价可达1∶103~1∶105,W estern印迹显示该M cAb既能特异性地结合精子膜蛋白中相对分子质量(Mr)约为34 000的天然抗原,又能特异性地结合Mr约为27 000重组P34H蛋白。结论:用上述方法成功制备抗P34H M cAb,为进一步研究P34H与男性生殖的关系奠定了基础。     

免疫调控相关基因C12orf28在免疫组织中的分布特征

目的：制备抗人C12orf28多克隆抗体,明确C12orf28编码蛋白在免疫组织中的分布特征。方法选取免疫原性高、特异性强的羧基端257个氨基酸作为目的片段,以人外周血单个核细胞（PBMC）cDNA为模板,采用PCR获得目的基因C12orf28C257;构建其原核表达载体pET32a（＋）-C12orf28C257,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白;将重组蛋白免疫大耳白大白兔制备兔源性多克隆抗体,采用ELISA和Western blot分析检测多克隆抗体效价和特异性,采用Western blot明确C12orf28的组织分布特征。结果 PCR扩增得到C12orf28C257目的基因片段,诱导表达重组蛋白并制备了其多克隆抗体。ELISA分析结果显示,多克隆抗体效价＞1︰1.28×106,Western blot分析鉴定得出多克隆抗体具有较高的特异性。结论未知功能基因C12orf28在胎儿肠、淋巴、胸腺和心肌等组织中均有不同程度的表达。     

肝癌相关蛋白FAM172A2的克隆表达及多克隆抗体制备

目的 构建肝癌相关蛋白FAM172A2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗FAM172A2蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,扩增FAM172A2目的基因片段1113bp,构建原核表达载体,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.诱导其大量表达后纯化、复性并制备多克隆抗体,Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性及其效价.结果 扩增获得FAM172A2基因片段,成功诱导FAM172A2融合蛋白表达并制备其多克隆抗体.ELISA检测证实其效价＞1∶160000,且特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21( DE3)能够成功表达FAM172A2蛋白,获得高特异性、高效价兔抗FAM172A2蛋白的多克隆抗体.     

兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用

目的制备大鼠精子发生相关蛋白LM23的合成肽多克隆抗体,对其特性进行初步鉴定,并对LM23多克隆抗体进行初步应用。方法利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列。应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白N端第1～20和第274-291个氨基酸多肽（接近C端）,经C18的RP—HPLC纯化后,通过高碘酸钠法,将纯化的LM23蛋白的多肽与KLH交联,免疫新西兰大耳白兔,获得LM23蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法鉴定多克隆抗体效价。通过Westernblot方法鉴定LM23多克隆抗体的特异性并研究LM23在大鼠睾丸中的表达;通过免疫组化方法研究LM23在大鼠睾丸组织和细胞中的定位。结果化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第1～20,第274-291个氨基酸多肽,纯化后两条多肽纯度都达到90％以上,符合免疫用抗原标准。将多肽与KLH交联,用于免疫动物。经ELISA鉴定,两种多克隆抗体的效价分别达到1：64000和1：128000。应用大鼠睾丸组织切片进行LM23—18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究,发现精母细胞有阳性颗粒反应,且LM23主要表达于细胞核。Westernblot研究证实,LM23—18肽多克隆抗体可特异识别大鼠睾丸组织中相对分子萤（Mr）约为36kD的LM23蛋白。结论所制备的LM23合成肽多克隆抗体可用于ELISA、Westernblot及免疫组化研究。LM23合成肽多克隆抗体的制备为进一步研究LM23的功能和作用机制提供了有力支持。