波尔定对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响

目的研究波尔定对NF-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的小鼠单核细胞(RAW264.7)向破骨细胞(OC)分化及骨吸收功能的影响。方法采用RANKL(50 ng/ml)诱导RAW264.7细胞向OC分化,不同浓度波尔定(1、10、20、40、80μmol/L)联合分化培养。培养第4d采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,计算OC样细胞数量;比色法测定TRAP活性;Real-time PCR法检测各组OC标志性基因核因子κB受体活化因子(RANK)、活化T细胞核因子1(NFATc1)和c-fos基因的表达;CCK-8法检测波尔定对OC的毒性。培养至第9d,采用甲苯胺蓝染色并用Leica Qwin图像分析系统计算骨吸收陷窝面积。结果与对照组比较,TRAP阳性OC数量、TRAP活性、OC标志性基因RANK、NFATc1和c-fos的表达量及骨陷窝面积,随着波尔定浓度增加而减少,与对照组比较,20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L波尔定可明显减少OC数量和TRAP活性(P0.05,P0.01),下调OC标志性基因RANK、NFATc1和c-fos的表达量及骨陷窝面积(P0.05),但以上浓度波尔定对OC均未产生毒性。结论波尔定对RANKL诱导的RAW264.7细胞向OC的分化及骨吸收功能具有抑制作用。     

α-MEM培养基和高糖DMEM培养基对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响

目的比较α-MEM和高糖DMEM两种培养基对小鼠破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞分化的影响。方法 (1)根据培养基和是否添加核因子κB受体激活蛋白配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)将细胞分为4组:α-MEM培养基组、添加RANKL的α-MEM培养基组、高糖DMEM培养基组、添加RANKL的高糖DMEM培养基组;(2)于培养第3天收集细胞,分别通过q PCR、免疫印迹实验观察分化相关标记物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、活化的T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1)、核因子κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)和组织蛋白酶(Cathepsin)K的mRNA及蛋白表达水平,并做TRAP染色观察各组成熟破骨细胞的形成情况,探讨添加RANKL后α-MEM培养基和高糖DMEM培养基对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。结果 (1)与添加RANKL的高糖DMEM培养基相比,添加RANKL的α-MEM培养基使RAW264.7细胞的分化相关标记物TRAP、NFATc1、RANK及cathepsin K的mRNA表达水平增加,TRAP、NFATc1及cathepsin K的蛋白表达水平增加;(2)在α-MEM培养基或高糖DMEM培养基中添加RANKL均可使RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞,但添加RANKL的α-MEM培养基处理的细胞组中形成的成熟破骨细胞更多。结论添加RANKL的α-MEM培养基有利于RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

RANK信号调控破骨细胞分化与成熟的研究进展

破骨细胞来源于微环境造血前体细胞,它的生存、增殖、分化和激活需要巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)参与。RANKL与相应的RANK受体结合,从而刺激破骨前体细胞分化成为破骨细胞。这一过程由不同的调节蛋白和激酶来调控,并且依赖于RANKL-RANK信号。本文中,笔者总结了目前已知的在破骨细胞发生过程中调节RANK信号的机制。在早期阶段,RANK信号的调节通过募集调节蛋白如肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6),引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)以及转录因子核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)的活化。活化的NF-κB进一步激活调节破骨细胞生成的重要因子-T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1, NFATc1)。在信号传递的中间阶段,共刺激信号通过激活磷脂酶Cγ2(phospholipase Cγ2, PLCγ2)连同c-Fos/AP-1引起钙离子(Ca~(2+))振荡,同时Ca~(2+)信号促进NFATc1的产生。在破骨细胞生成的晚期阶段,NFATc1入核诱导大量的破骨细胞特异性靶基因的表达,从而使细胞融合并发挥其功能。     

核转录因子-κB与锌指蛋白A20在瘢痕疙瘩的表达

目的 检测核转录因子-κB( nuclear factor-κB,NF-κB)和锌指蛋白A20 (zinc finger protein,ZFP A20)在瘢痕疙瘩组织中的表达,了解NF-κB信号通路的激活情况及其与瘢痕疙瘩形成的相互关系.方法 应用免疫组织化学染色技术、反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测16例瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中NF-κB p65和ZFP A20的蛋白表达及mRNA表达.结果 人正常皮肤组织中NF-κB p65的表达低于瘢痕疙瘩组织;ZFP A20的表达高于瘢痕疙瘩组织(P＜0.05).结论 NF -κB信号通路异常及ZFP A20的表达降低可能参与瘢痕疙瘩的形成.     

NF-κB激活在大鼠心肌细胞缺血-再灌注损伤中的意义

目的 从心肌核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)途径研究心肌缺血-再灌注损伤早期较多细胞因子表达的分子机制. 方法建立大鼠离体工作心脏模型,66只大鼠随机分为实验组和对照组.实验组于缺血5、15分钟和对照组于缺血0、5、15、30分钟、再灌注5、15、30、45和60分钟分别测定NF-κB的脱氧核糖核酸(DNA)结合活性变化、细胞质IκBα水平和肿瘤坏死因子α(TNF-α) mRNA的表达. 结果对照组短时间缺血即引起NF-κB的DNA结合活性增强,同时细胞质IκBα水平明显下降;再灌注后NF-κB的DNA结合活性明显增强,细胞质IκBα水平有所恢复.实验组NF-κB的DNA结合活性明显受抑制,TNF-α mRNA的表达亦受到抑制. 结论心肌缺血-再灌注过程中NF-κB由两种不同的途径激活,激活的心肌NF-κB有p65-p50和p50-p50两种形式,NF-κB的快速活化是心肌缺血-再灌注早期较多细胞因子表达的始动因素.     

核因子-κBp65特异性小干涉核糖核酸重组腺病毒的抑制作用

目的 在大鼠关节内观察核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(siRNA)重组腺病毒对靶基因的抑制作用.方法 在SD大鼠膝关节内,筛选合适的病毒剂量.利用β-gal染色鉴定重组腺病毒感染组织的特异性,应用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定重组腺病毒对NF-κB转录活性的影响,应用Western blot测定重组腺病毒对软骨和滑膜细胞内NF-κB65的抑制作用.结果 重组腺病毒在大鼠膝关节内的最佳剂量为1.6×108 pfu/ml,可以感染关节内软骨和滑膜组织,并在软骨和滑膜细胞内减低NF-κB转录活性,抑制目的 基因的表达.结论 特异性NF-κBp65siRNA的重组腺病毒载体可以在关节软骨和滑膜细胞内抑制目的 基因的表达.     

阿司匹林体外抑制破骨细胞生成的分子机制研究

目的 探讨阿司匹林对破骨细胞生成的影响及其分子机制。方法 体外培养RAW264.7细胞,以100 ng/ml核激活因子κB( NF-κB)受体配体(RANKL)诱导培养,并同时添加不同溶度的阿司匹林(0,0. 25,0. 5,1. 0,1. 5 mmol/L)培养5天。在不同时间点,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的方法来观察破骨细胞诱导生成能力,用实时荧光PCR方法检测其破骨细胞系标志基因,包括组织蛋白酶K( CTSK)、TRAP、基质金属蛋白酶9( MMP-9)和降钙素受体(CTR) mRNA的表达。裂解不同培养条件的细胞并提取蛋白上样,行western印迹检测NF-κB通道蛋白的表达以及有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKS)通道蛋白的表达,通过免疫荧光的方法分析确定NF-κB的P65的核易位。结果 阿司匹林抑制RANKL诱导的破骨细胞生成,随着阿司匹林浓度增加,破骨细胞形成数量明显减少;其标志性基因TRAP、CTSK、MMP9及CTR的mRNA表达均有所下调;磷酸化的P65、P50、IKB-a、P38以及氨基端激酶(C-JNK)和胞外信号调节蛋白激酶(ERK)蛋白表达均有所减少,而其非磷酸化的蛋 白表达水平无明显变化。阿司匹林同时对NF-κB P65的核易位也表现出抑制效果。结论 在RAW264. 7细胞系中,阿司匹林通过抑制NF-κB系统(P65、P50、IKB-a)和MAPKS系统(P38、C-JNK和ERK)通道的激活来抑制破骨细胞的生成,且在一定范围内和阿司匹林浓度呈正相关。阿司匹林可能具有临床预防及治疗骨质疏松的潜能。     

核因子-κB在重症急性胰腺炎中的作用

核因子-κB(nuclear factor κappa B,NF-κB)是细胞中一个重要的转录因子,它参与调控免疫反应、淋巴细胞分化和生长控制等多种生物进程。本文着重综述NF-κB蛋白家族成员的情况及其相互作用,NF-κB可能激活的途径及其在重症急性胰腺炎发病中的作用及其机制,以期为重症急性胰腺炎及一切NF-κB有关疾病的治疗提供新的思路。     

槲皮苷抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收

[目的]探讨槲皮苷对核因子κB受体激动剂配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能的影响。[方法]通过CCK-8法观察不同浓度槲皮苷(0~800μmol/L)干预不同时间(48 h、96 h)对RAW 264.7细胞的生存影响,确定合适的体外用药浓度;利用体外RANKL诱导RAW 264.7细胞形成破骨细胞体系,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色计数评价槲皮苷(200、400μmol/L)对破骨细胞形成和生存的影响;通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价槲皮苷(200、400μmol/L)3 d内对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响;釆用实时定量(Real-Time)PCR技术,检测槲皮苷(200、400μmol/L)对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因NFATc1、TRAP和c-fos表达水平的影响。[结果]细胞生存实验发现槲皮苷干预96 h后,槲皮苷(0~800μmol/L)对RAW 264.7细胞4 d内生存未发现显著影响;通过TRAP染色发现200、400μmol/L槲皮苷能显著抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成;通过骨片吸收实验发现200、400μmol/L槲皮苷3d内能显著降低骨吸收面积,提示其抑制成熟破骨细胞骨吸收功能;同时,槲皮苷能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)c1、TRAP和c-fos基因表达。[结论]槲皮苷通过抑制NFATc1,TRAP和c-fos的表达,来抑制体外RANKL诱导的破骨细胞形成和骨吸收功能,是一种潜在治疗骨质疏松药物。     

lncRNA HOXA11-AS抑制骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与基质降解的作用研究

目的研究长链非编码RNA(long-nocoding RNA,lncRNA)HOXA11-AS在骨关节炎(osteoarthritis,OA)的大鼠软骨细胞中的表达情况,及其对软骨细胞凋亡、基质降解以及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法采用弗氏完全佐剂注射大鼠构建OA大鼠模型,造模后分离培养软骨细胞;小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术抑制软骨细胞中HOXA11-AS表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测转染siRNA不同时间后软骨细胞的活力;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测软骨细胞中HOXA11-AS及基质金属蛋白酶13(matrix metallo protein-13,MMP-13)、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type 5 motifs,ADAMTS-5)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达情况;流式细胞术检测软骨细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测软骨细胞上清液中Bcl-2相关X蛋白(Bcl 2-associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况;蛋白质印迹法(western blot)检测MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、aggrecan和抗核因子κB抑制蛋白(anti-nuclear factor kappa B inhibitory protein,IκBα)、抗磷酸化核因子κB抑制蛋白(anti-phosphorylated nuclear factor kappa B inhibitory protein,p-IκBα)、抗核因子κB 65(nuclear factor kappa B,NF-κB 65)的表达,免疫荧光染色检测NF-κB在软骨细胞细胞核中的表达情况。结果与正常组大鼠软骨细胞相比,HOXA11-AS在OA大鼠软骨细胞中高表达;与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞活力显著下降,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达水平显著升高,而抑凋亡因子Bcl-2的表达水平显著下降;同时,与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞collagenⅡ和aggrecan的基因和蛋白表达水平明显降低,MMP-13和ADAMTS-5基因及蛋白表达水平明显升高,IκBα蛋白表达水平显著下降而p-IκBα和NF-κB p65的表达水平显著增高,此外,NF-κB在HOXA11-AS siRNA组细胞核中明显表达。结论 lncRNA HOXA11-AS可以抑制骨关节炎大鼠软骨细胞的凋亡以及基质降解,并阻止NF-κB信号通路的激活。     

白细胞介素-1β激活核转录因子-κB介导A549细胞分泌白细胞介素-8的研究

目的研究白细胞介素-1β(IL-1β)对肺II型上皮A549细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)的诱导作用,探讨相关的细胞内信号通道的激活和传导的机理。方法以1ng/ml终浓度的IL-1β干预经核转录因子-κB(NF-κB)的IKK2复合物抑制物(AS602868)预处理的A549细胞,Western blot检测IL-1β干预后细胞内磷酸化IκBα(p-IκBα)和IκBα蛋白的表达水平;激光扫描共焦显微镜(LSCM)检测NF-κB的p65和p50蛋白的核转移过程;ELISA检测NF-κB的p65和p50蛋白与DNA结合活性及IL-8蛋白的释放。结果IL-1β干预后细胞内p-IκBα蛋白明显升高,IκBα蛋白明显下降;LSCM扫描显示p65和p50蛋白从胞浆向胞核转移,同时p65和p50与DNA结合活性明显升高(P<0.01);IL-8的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。细胞经AS602868的预处理,阻断了细胞内p-IκBα蛋白升高和IκBα蛋白降解;减少了p65和p50蛋白的核转移和与DNA结合活性(P<0.01);降低了IL-8蛋白的表达水平(P<0.01)。结论IL-1β通过激活NF-κB介导了A549细胞分泌IL-8,结果提示可能通过抑制NF-κB信号通道的方法,减轻呼吸机相关肺损伤(VALI)的生物性损伤。     

核因子κB诱骗剂对膀胱癌中趋化因子基因表达的影响

目的 探讨核因子κB(NF—κB)诱骗剂对膀胱癌中趋化因子表达的影响。方法 电泳移动变换分析(EMSA)检测不同处理时NF—κB DNA联结活性的改变；RT—PCR和Western blot检测p65表达的变化；RT—PCR检测趋化因子IL—8、MCP—1，RANTES表达变化。结果 NF—κB诱骗剂抑制TNF—α诱导的NF-κB激活，也抑制TNF—α激活p65、IL8、MCP—1和RANTES；突变体NF-κB诱骗剂对这些指标无作用。结论 膀胱癌中可见趋化因子表达，并被TNF—α激活，NF—κB诱骗剂可对这种激活起抑制作用。     

NF-κB信号转导通路在瘢痕疙瘩中的异常表达

目的:观察核转录因子-κB(NF-κB)信号转导通路在瘢痕疙瘩组织中的异常表达,以探讨瘢痕疙瘩的发生机制。方法:采用组织免疫组化、RT-PCR、TransAMTMNF-κBp65Kit,分析15例瘢痕疙瘩组织以及10例正常皮肤标本中NF-κBp65以及其上游抑制因子IκB-α转录、翻译以及DNA结合活性水平。结果:NF-κBp65以及DNA结合活性在瘢痕疙瘩中表达高于正常皮肤组织,其抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩中表达低于正常皮肤组织(P<0.05)。结论:NF-κB信号转导通路在瘢痕疙瘩中的异常表达可能是其潜在的发生机制。     

核因子-κB反义寡核苷酸对肝纤维化小鼠肝组织核因子-κB活性和病理改变的影响

目的 应用核因子(NF)-κB反义寡核苷酸(ASON)治疗肝纤维化小鼠模型,观察NF-κB p65 ASON对小鼠肝组织NF-κB活性和肝纤维化程度的影响,探讨NF-κB p65 ASON治疗肝纤维化的可能机制.方法 实验小鼠分组:正常组(8只)、肝纤维化模型组(8只)、反义寡核苷酸(NF-κB p65 ASON)治疗组(8只)、正义寡核苷酸(SON)治疗组(8只)、错义寡核苷酸(MSON)治疗组(8只)、NF-κBp65 ASON对照组(8只)、SON对照组(8只)和MSON对照组(8只);采用凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测NF-κB DNA结合活性;病理切片(Masson染色)评价肝纤维化小鼠模型肝纤维化程度.结果 NF-κB p65 ASON治疗组小鼠肝组织NF-KB活性(12411.75±502.78)、肝纤维化病理积分(1.13±0.64)比模型组(16 346.88 ±449.05、2.88±0.64)明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).soN治疗组(16460.38±575.26、2.75±1.17)和MSON治疗组(15 959.25±746.27、3.00±0.53)的NF-κB活性、肝纤维化病理积分与模型组比较差异无统计学意义(P>0.01).结论 NF-κB p65 ASON能显著抑制小鼠肝组织的NF-κB活性,降低肝纤维化程度.     

siRNA下调NF-κB p65 基因表达影响人胆管癌QBC939细胞凋亡

目的运用RNA干扰技术下调胆管癌细胞株QBC939中核转录因子κB(NF-κB)p65基因表达对其肿瘤细胞生长的抑制作用。方法以阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作为转染试剂,将体外合成的人NF-κB p65的siRNA转染入胆管癌细胞QBC939。RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA的表达。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变。运用免疫组化、流式细胞仪、激光共聚焦法检测p65基因表达下调对QBC939细胞凋亡的影响。结果体外合成的人NF-κB p65 siRNA有效抑制了QBC939细胞中NF-κB p65 mRNA的表达(P0.01),同时ELISA结果显示,靶向NF-κB p65 siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P0.05),免疫组化DAPI核染色、流式细胞仪及激光共聚焦检测观察显示下调p65基因表达能够诱导QBC939细胞凋亡。结论 NF-κB p65的siRNA在胆管癌细胞QBC939调控方面起重要作用,通过沉默其表达可诱导胆管癌细胞凋亡抑制其生长增殖。     

雷公藤内酯醇对AngⅡ介导的肾小球系膜细胞核因子-κB活化及MCP-1表达的影响

目的：观察不同剂量雷公藤内酯醇对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的肾小球系膜细胞（GMC）核因子-κB（NF-κB）活化及单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达的影响，探讨雷公藤内酯醇抑制肾小球系膜细胞炎症因子表达的可能机制。方法：分离培养大鼠GMC，用10^-6mol／L AngⅡ刺激GMC，将培养的大鼠GMC随机分为5组：正常培养对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度的雷公藤内酯醇共孵育组。分别采用酶联免疫激光扫描共聚焦显微镜、ELISA、RT—PCR法、Western Blot法，检测GMC内NF-κB p65核易位阳性率、细胞培养上清液中MCP-1水平、GMC内MCP-1 mRNA表达及ⅠκBα蛋白表达水平。结果：雷公藤内酯醇呈剂量依赖性下调AngⅡ介导的大鼠GMC内NF-κB p65水平，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC MCP-1及MCP-1 mRNA的表达，抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC内ⅠκBα蛋白表达下调。结论：雷公藤内酯醇能够抑制AngⅡ诱导的大鼠GMC ⅠκB的磷酸化降解及NF—κB活化；抑制AngⅡ诱导的大鼠GMCMCP-1 mRNA表达MCP-1分泌。     

柚皮苷对共培养体系中成骨细胞活性及破骨细胞分化的影响

目的研究在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,柚皮苷对成骨细胞活性和破骨细胞分化的影响。方法将成骨细胞(MC3T3-E1细胞株)和破骨细胞(RAW264.7细胞株)以2∶1的比例分别培养至Transwell小室的上室和下室。根据培养基是否含有柚皮苷分为对照组和柚皮苷(2ng/ml组、20 ng/ml组、200 ng/ml组),培养7 d后对下室破骨细胞进行TRAP染色和骨吸收陷窝鉴定;荧光定量PCR分析成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)基因和破骨细胞分化基因活化T细胞核因子-1(NFATc-1)、活化T细胞核因子-2(NFATc-2)和核因子κB受体激活蛋白(receptor activator of NF-κB,RANK)的相对表达量。结果与对照组相比,柚皮苷可以促进成骨细胞OPG、RANKL的表达量且可提高OPG/RANKL的比值,差异有统计学意义(P0.05);20 ng/ml柚皮苷TRAP(+)细胞数(5.82±3.37)明显少于对照组(20.56±7.69),差异有统计学意义(P0.05);柚皮苷可抑制破骨细胞NFATc-1、NFATc-2的表达,促进RANK的表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论柚皮苷可促进共培养条件体系中成骨细胞OPG和RANKL的表达以及抑制破骨细胞的分化,与上调OPG/RANKL的比值有关。     

核转录因子κB抑制剂抑制表皮生长因子诱导胰腺癌细胞侵袭研究

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）在胰腺癌组织中表达明显增高，核转录因子KB（nuclear factor kappaB，NF-κB）是参与调控肿瘤侵袭和转移的相关基因，二者均与肿瘤的侵袭和转移密切相关。本实验通过研究NF-κB抑制剂对EGF诱导胰腺癌细胞侵袭能力的影响，探讨抑制NF-κB信号转导通路在胰腺癌治疗中的作用。[第一段]