双向差速法纯化大鼠牙囊细胞

目的：利用牙囊细胞和成釉细胞贴壁速度及酶消化分离速度不同的特点,建立一种简便、快速纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法取新生5~6 d SD大鼠下颌第一磨牙牙胚,在体视显微镜下剥离牙囊及成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用差速贴壁法和差速传代法纯化牙囊细胞。结果原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第2~3代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈梭形或三角形,免疫组织化学染色显示抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论双向差速法是一种高效、简便的纯化牙囊细胞的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

脂肪干细胞的培养鉴定及多向诱导分化

目的:进行脂肪干细胞的分离、培养和鉴定,阐明脂肪干细胞的生物学特性。方法:无菌条件下取新西兰大耳白兔腹股沟处脂肪组织,从中获得纯化的脂肪来源干细胞。HE染色观察细胞形态;流式细胞术检测细胞表面标志物;多向诱导后检测其成脂、成骨及成软骨分化能力。结果:提取的兔脂肪干细胞形态为成纤维细胞样,生长旺盛,可以稳定增殖20代以上。流式细胞术分析显示CD44呈阳性表达,CD34、CD14呈阴性表达;经体外诱导培养后,向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。结论:本实验成功分离、培养和鉴定了脂肪干细胞,脂肪干细胞体外增殖稳定,并且具有成脂、成骨及成软骨多向分化潜能。     

大鼠脂肪干细胞体外培养及成骨诱导分化研究

目的:观察SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的基本生物学特性、鉴定其诱导成骨分化潜能。方法:无菌条件下取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,0.1%I型胶原酶消化,分离培养。显微镜下观察细胞形态;采用MTT比色法绘制细胞生长曲线;用流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导培养,分别用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色和油红O染色鉴定成骨诱导效果。结果:从SD大鼠脂肪组织中分离获得的ASCs呈长梭形或多角形,呈集落生长;细胞生长曲线呈"S"型,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析示:CD29、CD90高表达,CD34、CD45低表达;成骨诱导后ALP染色及茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性。结论:分离培养的细胞为ASCs,具有成骨潜能。     

人髁突来源骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养和鉴定方法以及多向分化能力．为骨组织工程提供种子细胞。方法取髁突良性肥大患者被切除的髁突。冲洗收集骨髓细胞．采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化MSCs．取生长良好的P3或P4代MSCs进行检测：（1）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析；（2）流式细胞仪检测MSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期；（3）脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞多向诱导分化及相关检测。结果（1）利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从人髁突分离MSCs．经传代后细胞形态呈梭形．成纤维细胞样．均匀一致；（2）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示MSCs在传代后经历游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和平台期；（3）流式细胞仪检测结果显示所获得的MSCs纯度较高．细胞单一。CD44、CD29和CD55表面标记阳性率分别为100％、99．8％和86．6％，而CD34、CD45和CD106的阳性率仅为0．5％、2．9％和6．3％；（4）MSCs细胞周期检测结果为G0期和G1期91．9％、G2期2．4％和S期5．7％，说明大部分细胞仍处于静止期：（5）成脂诱导后细胞胞浆内可见脂滴，苏丹黑B、油红O染色均呈阳性；成骨诱导后，Vonkossa和茜素红染色均呈阳性：神经细胞诱导后，细胞由梭形变为有多个突起的神经元样细胞，甲苯胺蓝尼氏和GFAP免疫组化染色均为阳性。结论从人髁突骨髓中能分离出高度一致的MSCs，这些细胞具有多向分化能力．可作为骨组织工程的种子细胞。     

2型糖尿病大鼠脂肪干细胞体外成骨能力的研究

目的:比较2型糖尿病(T2MD)大鼠和正常SD大鼠脂肪来源干细胞(ASCs)的增殖及多向分化能力。方法:取16只SPF级8周龄SD大鼠,随机分为两组(n=8):糖尿病组,采用高脂高糖饲料构建T2DM大鼠模型;对照组常规饲料喂养,比较两组大鼠的血糖水平。建模成功8周后,分别培养两组大鼠腹股沟处的ASCs,显微镜下观察细胞形态;CCk-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导实验,实时定量PCR检测成骨诱导7 d时成骨相关基因的表达。结果:两组大鼠脂肪组织均可分离获得ASCs,且细胞形态和增殖能力无显著差异(P>0.05);两组细胞均高表达CD44和CD90,低表达CD34和CD45;T2DM大鼠P3代ASCs成脂诱导后油红O染色较正常组强,而成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色较正常组弱;ALP蛋白活性检测较正常组低;ALP、OCN、OPG和RUNX2等成骨相关基因的表达水平较正常组低。结论:T2DM大鼠ASCs体外成骨分化能力较弱。     

牙囊干细胞诱导成骨的体外研究

目的:体外研究牙囊干细胞(DFSC)的成骨能力,为其在牙周组织工程中的应用提供理论基础。方法:结合组织块法和酶消化法分离培养DFSC,用有限稀释法纯化细胞,经细胞形态、免疫组化和流式细胞技术鉴定DFSC后,然后进行成骨诱导,并通过碱性磷酸酶和茜素红染色、Real-timePCR、Western-blot检测成骨/牙骨质细胞表面标记物ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达。结果:DFSC具有较强的增殖能力,免疫组化示波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性;DFSC高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105、CD146;随着诱导时间的增加,其ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达明显上调(P＜0.05)。结论:DFSC是牙周组织再生良好的种子细胞,必将为牙周组织再生治疗开辟新的途径。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外分离、培养并对下颌骨来源的BMMSCs进行鉴定.为骨组织工程提供种子细胞.方法:取兔下颌骨中的骨松质,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养,取P2或P3代BMMSCs进行检测.倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞多向诱导分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原标记.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞经传代后形态一致,呈梭形或三角形;细胞生长曲线显示,下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;克隆形成率为37％;成骨及成脂诱导形成钙结节及脂滴,茜素红及油红O染色呈阳性;成骨骼肌诱导desmin抗原标记阳性;流式细胞仪检测结果显示,所获得的下颌骨BMMSCs纯度较高.CD90和CD146表面标记阳性率分别为98.7％、98.1％.结论:从兔下颌骨分离的BMMSCs纯度较高,有强大的自我复制、增殖特性和体外多向诱导分化潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的:分离培养家兔脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs),观察体外培养生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力。方法:无菌条件下切取家兔腹股沟处脂肪组织,0.25%Ⅰ型胶原酶消化,分离培养原代细胞,取第3代ASCs做实验,用HE染色观察细胞形态,MTT比色法测定细胞生长曲线;用流式细胞仪检测其细胞表面标志物;用油红O染色和茜素红染色鉴定成脂和成骨诱导分化。结果:从家兔脂肪组织中分离获得的ASCs形态为长梭形,成纤维细胞样,生长活力旺盛,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析CD29呈阳性表达,CD31呈阴性表达;成脂诱导的细胞油红O染色阳性,成骨诱导的细胞茜素红染色阳性。结论:本实验分离培养的细胞为ASCs,具有成脂和成骨分化潜能。     

大鼠牙囊细胞体外培养与表型鉴定

目的：体外培养大鼠牙囊细胞（RDFCs）,鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法：选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白（Vimentin,VIM）和角蛋白（Cytokeratin,CK）鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen,CoL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（typeⅢ collagen,CoL-Ⅲ）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。结果：细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示OPN、BSP、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论：大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。     

BMP-2和地塞米松联合诱导大鼠牙囊细胞与β-磷酸三钙生物陶瓷相容性的实验研究

目的：以BMP-2和地塞米松诱导的大鼠牙囊细胞作为种子细胞,β-磷酸三钙作为细胞支架材料,体外构建细胞生物材料复合体,观察大鼠牙囊细胞在β-磷酸三钙生物陶瓷材料的贴附、增殖情况。方法：收集培养的第3代RDFCs,血清饥饿同步化后,细胞分为四组,分别为BMP-2、Dex、BMP-2＋Dex诱导组及空白对照组。诱导3d后,将密度为4×106/ml的细胞悬液0.1ml均匀接种到预制好的β-TCP支架材料上,分别于体外培养3d、7d取细胞材料复合体,通过细胞计数、扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的贴附、增殖情况。结果：细胞计数发现,7d时BMP-2＋Dex诱导组细胞数量显著高于BMP-2诱导组、Dex诱导组（P〈0.01）。扫描电镜观察,β-TCP表面呈多孔三维立体网状结构。细胞接种3 d和7d时,单位面积内BMP-2＋Dex诱导组细胞数量均明显高于BMP-2诱导组、Dex诱导组、对照组。结论：β-磷酸三钙具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊细胞的贴附和生长,证明BMP-2和地塞米松联合作用促进大鼠牙囊细胞的增殖、分化的协同效应,为进一步使用BMP-2和地塞米松诱导大鼠牙囊细胞,并与β-磷酸三钙生物陶瓷复合后体内移植实验提供依据。     

差速传代纯化大鼠牙囊细胞

目的:建立一种简捷的分离培养和纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法:分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚,剥离牙囊和成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用多次差速传代纯化牙囊细胞。结果:原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第4代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈长梭形或三角形,免疫组化染色抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论:利用多次差速传代可从混合培养的原代细胞中获得纯化的牙囊细胞。     

BMP-2和地塞米松对体外培养大鼠牙囊细胞矿化能力的影响

目的:探讨BMP-2和地塞米松联合作用对大鼠牙囊细胞分化能力的影响,为牙囊细胞在牙周组织工程中的应用提供实验依据。方法:取生长状态良好的第3代大鼠牙囊细胞,血清饥饿同步化后,分别加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex(10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培养液,通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒、钙化结节染色分别检测不同诱导条件下对大鼠牙囊细胞分化的影响。结果:经BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导后,体外培养的大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性均显著高于未诱导组,各组间ALP活性与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。BMP-2+Dex诱导组ALP活性最强,与BMP-2诱导组间差异有统计学意义(P<0.01),而与Dex诱导组间ALP活性则差异无统计学意义(P>0.01)。培养14d时,BMP-2+Dex诱导组牙囊细胞ALP活性增强最为显著,与BMP-2诱导组及Dex诱导组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。矿化结节计数分析显示,各组细胞矿化结节形成的数量及面积明显存在显著的差异,BMP-2、Dex、BMP-2+Dex诱导组与未诱导组相比,其矿化结节形成量差异均有统计学意义(P<0.01),BMP-2+Dex诱导组矿化结节形成量明显大于BMP-2和Dex单独诱导组。结论:BMP-2、地塞米松均能促进牙囊细胞的分化,然而两者联合作用促分化的能力最为显著,提示其在牙周组织工程中的应用前景。     

牙胚细胞的分离培养

目的：分离培养牙胚细胞。方法：选择出生后（PN）8天的SD大鼠,从第一磨牙牙胚上撕脱牙囊和成釉器组织,切取牙胚颈部组织,剁离牙乳头组织,分别进行细胞培养,通过差速消化法分离符种牙胚细胞。结果：牙囊、牙乳头、成釉器和上皮根鞘细胞被分离纯化出来。结论：利用差速消化法可同时分离培养4种主要的牙胍细胞。     

人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察

目的:体外分离、培养人乳牙牙髓干细胞。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,以获得人乳牙牙髓干细胞。有限稀释法分离纯化,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,细胞爬片行HE染色、碱性磷酸酶染色、抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色。结果:通过有限稀释法获得了克隆形成率为11～24个/103,细胞群体倍增时间为39.84h,HE染色细胞形态为梭形、细胞体小、胞核大的干细胞。且碱性磷酸酶染色阳性,抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色阳性。结论:人乳牙牙髓中可分离培养出牙髓干细胞。     

大鼠成釉器细胞的分离纯化

目的：寻找一种大鼠成釉器细胞分离纯化的简捷方法。方法：分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚，剥离牙囊和成釉器，酶消化法原代混合培养。采用多次差别消化法去除成纤维样细胞，纯化上皮样细胞，并进行抗角蛋白染色和RT—PCR检测釉原蛋白、成釉蛋白mRNA表达。结果：原代细胞为混杂细胞，经2～3次差别消化可完全去除成纤维样细胞。上皮样细胞呈多角形，铺路石样生长，抗角蛋白染色阳性，表达釉原蛋白、成釉蛋白mRNA。结论：本研究通过多次差别消化获得了纯化的大鼠成釉器细胞。     

乳牙牙髓干细胞体外诱导成骨细胞的实验研究

目的:体外分离、培养人乳牙牙髓干细胞,并向成骨细胞诱导.方法:采用酶消化法分离获得人乳牙牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测定生长曲线,细胞爬片行HE染色,抗波形蛋白(Vimentin)、CD44和STRO-1免疫组化染色,并向成骨细胞诱导,行HE染色、碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、Van Gieson染色和抗骨钙素免疫组化染色进行鉴定.结果:通过有限稀释法获得了人乳牙牙髓干细胞,并诱导成成骨细胞,表现出与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特征.结论:成功从人乳牙牙髓中分离出牙髓干细胞,并诱导为成骨细胞.     

基质细胞趋化因子-1对人牙周膜干细胞趋化因子受体——CXC亚家族受体4表达的影响研究

目的:证实人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)表达趋化因子受体——CXC亚家族受体4(cysteine X cysteine receptor 4,CXCR4)及探究趋化因子基质细胞趋化因子-1(stromalcell-derived factor1,SDF-1)和阻断剂AMD3100(商品名:普乐沙福)对CXCR4表达的影响,从而为探究牙周膜干细胞生物学效应的影响提供理论基础。方法:采用消化组织块法联合有限稀释法分离纯化得到hPDLSCs,取第3代hPDLSCs随机分为3组:阴性对照组、SDF-1组(200μg/L SDF-1),SDF-1+AMD3100组(200μg/L SDF-1+10 mg/L AMD3100)。利用Western blot检测CXCR4在hPDLSCs上的表达及在SDF-1、AMD3100作用下CXCR4表达的变化。结果:1.筛选后的hPDLSCs可被诱导分化为成骨细胞和成脂细胞,证实其具有多向分化潜能;利用流式细胞仪检测其细胞表型鉴定其符合牙周膜干细胞的免疫表型。2.Western blot检测结果显示hPDLSCs上表达CXCR4,且应用SDF-1后上调CXCR4的表达,SDF-1+AMD3100组无明显变化。结论:1.hPDLSCs可从新鲜离体牙的牙周膜中培养获得,经有限稀释法纯化后鉴定为间充质来源。2.hPDLSCs上表达CXCR4,SDF-1通过上调hPDLSCs上CXCR4的表达,AMD3100可阻断SDF-1与其受体CXCR4结合。