TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

TNF-α刺激下牙周膜干细胞与CD3+T细胞共培养对Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨炎症条件下牙周膜干细胞与CD3⁺T细胞共培养对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:拔除健康前磨牙及第三磨牙,获取健康牙周膜干细胞(H-PDLSCs);人外源性TNF-α炎症因子10ng/mL刺激PDLSCs(I-PDLSCs)。免疫荧光染色检测H/I-PDLSCs Wnt通路蛋白β-catenin和LEF-1的表达。采用免疫磁珠法获取人的CD3⁺T细胞。H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞分别以1∶10,1∶20,1∶50,1∶100共培养,共培养48h,提取各组PDLSCs的RNA,反转录为c DNA后,qPCR检测β-catenin、LEF1、TCF4的基因表达;以上述比例共培养后收集各组细胞进行流式细胞仪细胞周期检测。结果:免疫荧光检测I-PDLSCs组β-catenin、LEF-1的表达强于H-PDLSCs组。共培养比例为1∶20和1∶50时,H-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均降低;1∶20时TCF4 mRNA的表达水平增加,1∶50时降低。1∶20时,I-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均增加,而在1∶50时基因的表达水平均降低。1∶20及1∶50时TCF4的表达水平均降低。H-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10时与H-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著提高;1∶20、1∶50及1∶100时其PI指数显著降低。I-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10、1∶50及1∶100时与I-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著降低(P<0.05)。结论:炎症条件可激活牙周膜干细胞的Wnt/β-catenin信号通路,H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞以1∶20、1∶50可稳定的下调Wnt/β-catenin经典信号通路,证实Wnt通路参与炎症条件下PDLSCs的免疫调节。     

牙周膜干细胞免疫调节特性的研究进展

牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）具有多向分化的潜能，是牙周组织再生的首选种子细胞。近年来，大量研究证实PDLSCs还具有广泛的免疫调节特性，深入探究其具体分子机制对于牙周炎的治疗具有重要的指导意义。本文旨在归纳总结PDLSCs对各种免疫细胞的调控以及炎症环境对PDLSCs免疫特性影响的研究进展，以期为实现PDLSCs的异体移植提供重要理论依据，从而提升牙周组织再生的治疗效果。现有研究表明，PDLSCs对固有免疫细胞和获得性免疫细胞均具有一定的免疫抑制作用，炎症刺激可导致其免疫调节特性受损。然而，目前的研究主要局限于体外细胞试验，缺乏对体内环境下PDLSCs免疫调节作用的深入研究，基于细胞谱系示踪和条件性基因敲除技术的体内研究可能成为未来的主要研究方向。     

糖原合成酶激酶3β对炎症状态下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：探讨炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的变化及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthesis kinase,GSK3β）对其成骨分化能力的影响。方法：培养正常及慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞（H-PDLSCs,P-PDLSCs）,将两种PDLSCs体外成骨诱导7d,实时定量PCR检测细胞Runx2、 ALP、 OCN的基因表达水平, Western Blot检测p-GSK3β, GSK3β的蛋白表达情况。在成骨诱导时使用GSK3β特异性抑制剂LiCl刺激PDLSCs, ALP染色、 RealTime PCR检测PDLSCs成骨分化的情况。结果： P-PDLSCs的成骨化能力显著低于H-PDLSCs。 P-PDLSCs组p-GSK3β表达较H-PDLSCs组增高,成骨诱导后,两种PDLSCs中p-GSK3β表达降低,但GSK3β总蛋白表达水平增高。 LiCl抑制GSK3β后PDLSCs的ALP活性、 Runx2和OCN表达水平显著降低。结论：在慢性炎症微环境中, GSK3β的磷酸化可影响Wnt信号通路,抑制牙周膜干细胞的成骨分化。     

低氧条件下人牙源性干细胞促血管相关miRNAs的表达差异研究

目的: 探讨人根尖乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAPs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）和牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）在低氧条件下促血管相关微小RNA (miRNAs) 的表达及其意义。方法: 从离体牙中提取SCAPs、DPSCs 和PDLSCs,分别于常氧和低氧条件下培养1、3、5 d,通过实时定量PCR(RT-PCR) 检测细胞中已被证实具有特异性促血管相关功能的9个miRNAs的表达变化,以及低氧诱导因子1α (HIF-1α) 的表达变化。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 低氧条件下第5天,SCAPs中miR-126的表达相对升高,miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-130a、miR-132、miR-210、miR-503的表达相对降低;DPSCs中miR-21、miR-130a、miR-126和miR-210的表达相对升高,miR-132的表达相对降低;PDLSCs中miR-126、miR-210和miR-296的表达相对升高。SCAPs、DPSCs和PDLSCs中HIF-1α的表达相对升高。结论: 低氧条件下,SCAPs、DPSCs和PDLSCs中促血管相关miRNAs具有各自特征性的表达谱。     

牙周膜干细胞成脂分化的研究进展

牙周膜干细胞( periodontal ligament stem cells,PDLSCs)被认为是牙周组织工程理想的种子细胞,具有多向分化潜能。间充质干细胞在成脂和成骨分化过程中具有相互制约的平衡关系,成脂分化的诱导因素通常是成骨分化的抑制因素,反之亦然。本文就近年来PDLSCs成脂分化的诱导、鉴定方法及相关转录因子的研究进展进行综述,分析PDLSCs成脂分化的机制,探讨通过抑制PDLSCs成脂分化促进其成骨分化的可行性,为治疗牙槽骨吸收等骨骼性疾病提供参考。     

牙髓、牙周膜及脐带间充质干细胞三系分化能力的体外比较研究

目的:比较牙髓、牙周膜和脐带三种不同来源间充质干细胞的(Mesenchymal stem cells,MSCs)三系分化潜能.方法:培养分离人脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)、牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs);倒置显微镜观察细胞形态,体外诱导这3种MSCs向成骨、成脂和成软骨方向分化,通过茜素红染色、油红O染色、阿尔辛蓝染色分别鉴定细胞成骨、成脂和成软骨分化能力,进一步实时荧光定量PCR检测比较3种细胞成骨相关基因OCN和RUNX2及成脂相关基因PPAR-γ的表达水平.结果:这3种MSCs细胞形态略有不同,三者均可向成骨、成脂和成软骨方向分化,但其分化潜能有所差异,DPSCs成骨和成脂向分化能力强,UCMSCs则更适于成脂和成软骨向分化,而PDLSCs成软骨向分化较具优势.结论:DPSCs,PDLSCs和UCMSCs三系分化潜能不同,本研究为干细胞临床转化中选择理想细胞来源提供实验依据.     

年龄因素对人牙周膜干细胞培养和性能的影响

目的:探讨年龄因素对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)体外培养及其生物学特性的影响。方法:收集临床<30岁、>50岁具有完整牙根的第三磨牙各4个,分别刮取根面残留牙周膜进行PDLSCs分离培养,观察其细胞克隆形成能力、MTT方法检测生长曲线、流式细胞仪分析细胞表面分子,并进行体外成骨、成脂诱导,对比分析PDLSCs多向分化能力。结果:两组第三磨牙中均可培养出具有明显间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)特性的PDLSCs,但>50岁组获得的PDLSCs克隆形成率显著降低(P<0.05),其增殖、分化能力亦较<30岁组明显减弱(P<0.05)。结论:年龄因素对PDLSCs体外培养及其生物学特性具有明显影响;PDLSCs的基础和临床研究中,应充分考虑到病人年龄因素。     

生长激素释放肽对牙周膜干细胞增殖、凋亡影响的研究

目的 观察生长激素释放肽(Ghrelin)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖、凋亡的影响,探究其可能机制。方法 通过流式细胞术对培养的PDLSCs进行表面抗原鉴定,采用茜素红及油红O染色鉴定PDLSCs多向分化能力。CCK-8检测Ghrelin对PDLSCs增殖效应的影响;活死细胞染色检测Ghrelin作用下细胞状态;流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法、TUNEL染色分别检测Ghrelin及其受体GHS-R1α拮抗剂D-Lys3-GHRP-6(DLS)对饥饿诱导下PDLSCs凋亡的作用。结果 本研究中所培养的PDLSCs为间充质来源的多能干细胞。100、200 ng/mL Ghrelin能够显著促进PDLSCs的增殖(P<0.05)。Ghrelin可抑制饥饿诱导的细胞死亡及凋亡,且凋亡抑制效应可以被DLS所逆转。结论 Ghrelin促进PDLSCs增殖,抑制无血清饥饿诱导的细胞凋亡,可能与Ghrelin激活PDLSCs细胞表面受体GHS-R1α有关。     

成人牙周韧带干细胞分离培养及其定向分化的实验研究

干细胞(stem cell)是指具有高度增殖和自我更新能力,及多向分化潜能的细胞。在机体发育过程中,可存在处于不同分化等级的干细胞。我们对牙周韧带干细胞进行分离、培养,并进行脂肪化及矿化诱导,为进一步研究提供实验依据。1.资料和方法:选取年轻患者因正畸拔除的完好牙齿,刮取根中1/3牙周膜,采用组织块培养法得到牙周韧带细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行单细胞克隆,筛选牙周韧带干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),检测第三代PDLSCs波形蛋白和角蛋白表达,体外进行脂肪化及矿化诱导后对各克隆从碱性磷酸酶活性、矿化…     

MTA对牙周膜干细胞RANKL/OPG表达水平的影响

目的 探讨MTA对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的影响。方法 通过酶消化法分离培养PDLSCs,依据碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性筛选最佳MTA刺激浓度,将PDLSCs分别于对照组（普通培养基）和2 mg/mL MTA条件培养液培养3 d和7 d后,蛋白免疫印迹法分别检测RANKL、OPG蛋白表达。结果 MTA刺激3 d和7 d组,OPG蛋白表达较对照组升高,RANKL蛋白表达较对照组降低。结论 MTA可通过调节RANKL/OPG系统,参与调节PDLSCs成牙/骨及破牙/骨活性。     

阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中树突细胞的影响

目的探索阿司匹林及炎症对兔颊VX-2鳞状细胞癌上清液中树突细胞（DC）成熟及功能的影响。方法通过瘤粒植入术及机械创伤+高糖饮食的方法,建立兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型,将模型兔分为3组。实验组：制造颊癌及炎症后使用阿司匹林灌胃治疗3 d;对照组：制造颊癌及炎症后以生理盐水灌胃作为对照;空白组：不制造炎症的单纯肿瘤兔组。3 d后收集各组肿瘤标本,制成匀浆,取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养以使其向DC分化,采用流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、人类白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果实验组和对照组中CD83、CD86、HLA-DR阳性率均低于空白组（P<0.05）,而实验组和对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）;同样,实验组和对照组刺激T细胞增殖的能力弱于空白组（P<0.05）,而两组间刺激T细胞增殖的能力无明显差异（P>0.05）。结论炎症可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表达和功能发挥,短期、小剂量服用阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC的表型改善和功能发挥无明显作用。     

Bio-Gide生物膜与人牙周膜干细胞的生物相容性研究

目的:评价Bio-Gide生物膜与人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的生物相容性,为其作为细胞载体用于牙周组织工程提供依据。方法:体外分离培养人PDLSCs,经鉴定后与Bio-Gide生物膜浸提液共同培养,评价该膜材料的细胞毒性;将人PDLSCs接种于Bio-Gide生物膜后,通过扫描电镜和Hochest荧光核染色观察其在膜材料上的粘附、生长情况。结果:人PDLSCs和Bio-Gide生物膜浸提液共同培养后,其增殖率为122.66%,无细胞毒性;人PDLSCs接种于膜材料上培养1～12 d后扫描电镜观察可见,PDLSCs在膜材料上能正常增殖且成膜性生长;经Hochest荧光核染色观察人PDLSCs与膜材料的粘附率为86.7%。结论:Bio-Gide生物膜除具有良好的物理屏障外,无细胞毒性,且能支持PDLSCs的成膜性生长。     

牙周膜干细胞来源外泌体的生物学特性分析

目的 采用超速离心,分离牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）来源的外泌体,检测其生物学特性。方法 采用有限稀释法,体外分离、培养人PDLSCs。收集PDLSCs培养上清,采用梯度离心法分离、纯化外泌体。对PDLSCs来源的外泌体进行检测,透射电镜下观察外泌体形态;蛋白质印迹法检测外泌体表面标志CD9、CD63、CD81和TSG101的表达;纳米颗粒跟踪分析（nanosight tracing analysis,NTA）检测PDLSCs来源外泌体的产量及其粒径分布特征。结果 成功分离出PDLSCs来源的外泌体。透射电镜下可见,外泌体为碟形或椭圆形膜性结构,中央电子密度较低。免疫印迹结果显示,分离得到的囊泡表达外泌体特异性标志物CD9、CD63、CD81和TSG101。NTA显示,PDLSCs来源的外泌体浓度为（3.80±0.39）×10⁸颗粒/mL,粒径分布峰值在（119±12.1）nm。结论 采用梯度超速离心法可以得到PDLSCs来源的外泌体,其具有特征性的外泌体膜蛋白成分和形态特征。     

抗菌治疗对兔颊VX-2鳞癌感染性微环境中树突状细胞的影响

目的:探索抗菌治疗对兔颊VX-2鳞癌感染性微环境中树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟及功能的影响.方法:瘤粒植入形成兔颊VX-2鳞癌后,附加机械创伤及高糖饮食获得该鳞癌的炎症模型,再分为3组(n=6),A组:颊癌炎症模型使用抗生素治疗3d;B组:颊癌炎症模型以生理盐水代替抗生素对照;C组:单纯颊癌不做处理.3d后收集各组肿瘤标本,制成匀浆,取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养,流式细胞仪检测DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表达,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T细胞增殖的能力.结果:HLA-DR、CD83、CD86阳性率及刺激指数(stimulate index,SI)由高到低均分别为:C组＞A组＞B组(P＜0.05).结论:抗菌治疗有助于感染兔颊VX-2鳞癌微环境中树突状细胞的成熟及功能恢复.     

牵张力对牙周膜干细胞内质网线粒体偶联及其介导成骨分化能力的影响研究

目的    探究牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）在受到牵张力作用下的成骨分化能力及其内质网线粒体偶联的变化。方法    从牙周膜分离原代PDLSCs并进行传代培养,使用第3代细胞以施加或不施加牵张力处理分别作为实验组和对照组,并在加力后收取细胞进行成骨诱导培养,采用茜素红染色和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测PDLSCs成骨分化水平和成骨相关基因［Runt相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）］的表达水平。用透射电镜观察线粒体内质网的空间接触变化,采用qRT-PCR检测线粒体融合蛋白-1（mitofusion 1,Mfn1）和线粒体融合蛋白-2（mitofusion 2,Mfn2）的基因表达水平,采用线粒体膜电位检测试剂盒检测PDLSCs线粒体膜电位变化。结果    茜素红染色和qRT-PCR检测结果显示,施加牵张力后PDLSCs的成骨分化能力显著增强（P < 0.05）。透射电镜结果显示,与对照组相比,实验组PDLSCs内质网线粒体偶联长度与线粒体周长之比显著降低（P < 0.05）。实验组细胞Mfn2基因表达水平较对照组显著降低（P < 0.05）,但两组Mfn1基因表达变化差异无统计学意义（P > 0.05）。实验组细胞线粒体膜电位与对照组相比则显著升高（P < 0.05）。结论    施加牵张力可促进PDLSCs的成骨分化,其机制可能与抑制PDLSCs内质网线粒体的偶联、升高线粒体膜电位趋势有关。     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。