转基因番茄防龋疫苗的基础研究：I.变形链球菌pac基因唾液粘附区 …

目的 构建变形链球菌表面蛋白基因（ｐａｃ）唾液粘附区的植物表达质粒ｐＲＯＰ１和ｐＲＰＢ１。方法 用ＰＣＲ扩增的含变形链球菌表面蛋白唾液粘附区Ｐ１片段（１８４－１９４６ｂｐ）与植物的高效表达质粒ｐＲＯＫＣＰ结合,构建ｐＲＯＰ１表达质粒;且将此质粒与Ｂａｒ基因（抗除草剂基因）连接,构建表达质粒ｐＲＰＢ１,酶切电泳检测。结果 从ｐＰＣ４１中扩增的Ｐ１片段整合到ｐＲＯＫＣＰ的适当部位,构成重组质粒ｐＲＯＰ     

嵌合体SBR-CT~(ΔA1)植物表达质粒的构建

目的　构建含编码嵌合体SBR_CTΔA1 基因的植物表达质粒。方法　用PCR扩增的含编码嵌合体SBR_CTΔA1 基因的P2片段 (34 98～ 5 378bp) ,经TA克隆与pGEM_easy载体结合得到pTSC质粒 ,pTSC质粒经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后得到P2片段 ,P2片段与BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后的植物高效表达质粒pPOKⅡ定向克隆 ,构建pROSC表达质粒 ;且将此质粒与bar基因 (抗除草剂基因 )连接 ,构建重组质粒pROSB ,并经酶切电泳及DNA序列测定鉴定。结果　含编码嵌合体SBR_CTΔA1 基因的P2片段整合到pPOKⅡ的适当部位 ,插入相位正确 ,未改变目的基因的阅读框架 ;从pBARGUS分离出的bar基因整合到pROSC ,构成重组质粒pROSB。结论　本实验成功构建了携带编码嵌合体SBR_CTΔA1 基因的植物表达质粒pROSC和pROSB。     

嵌合体SBR-CT~(ΔA1)植物表达质粒的构建

目的　构建含编码嵌合体SBR-CTΔA1基因的植物表达质粒。方法　用PCR扩增的含编码嵌合体 SBR-CTΔA1基因的P2片段(3 498~5 378 bp),经TA克隆与pGEM-easy载体结合得到pTSC质粒,pTSC质粒经BamHⅠ 和KpnⅠ双酶切后得到P2片段,P2片段与BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后的植物高效表达质粒pPOKⅡ定向克隆,构建 pROSC表达质粒;且将此质粒与bar基因(抗除草剂基因)连接,构建重组质粒pROSB,并经酶切电泳及DNA序列测定鉴定。结果　含编码嵌合体SBR-CTΔA1基因的P2片段整合到pPOKⅡ的适当部位,插入相位正确,未改变目的基因的阅读框架;从pBARGUS分离出的bar基因整合到pROSC,构成重组质粒pROSB。结论　本实验成功构建了携带编码嵌合体SBR-CTΔA1基因的植物表达质粒pROSC和pROSB。     

变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建

目的构建含变异链球菌葡糖基转移酶多个免疫显性抗原表位的植物表达质粒p2355-gtfB,为其转化植物研究奠定物质基础,为可食防龋疫苗研究提供条件。方法以真核表达质粒pcDNA3-gtfB为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增含编码变异链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB。将回收纯化的PCR产物经T-A克隆技术克隆于中间载体pMD18-T,双酶切鉴定插入方向后,将目的基因从中间载体释放,再克隆至高效的植物表达载体p2355,用电转化法转化根癌农杆菌EHA105,对重组质粒阳性克隆株进行筛选与鉴定。结果通过对重组质粒T-gtfB进行酶切图谱分析,获得2.9 kb和3.7 kb的2个片断,将重组质粒p2355-gtfB进行酶切、PCR及测序分析,显示p2355-gtfB中插入基因长度为3 675 bp,基因序列与双脱氧链终止法的测定结果相同,证明植物表达质粒p2355-gtfB构建成功,开放阅读框架正确。结论本研究成功构建了含变异链球菌多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因的植物表达质粒p2355-gtfB,为可食性防龋疫苗的研究奠定了基础。     

p16基因对舌鳞癌细胞生物学特性影响的研究

ｐ16基因是一个多种肿瘤抑制基因 ,其编码蛋白为周期依赖性激酶 4(ＣＤＫ4)的抑制因子 ,能阻止ＣＤＫ4与细胞周期素Ｄ结合 ,从而使细胞周期阻滞在Ｇ1期[1] 。我们为了探讨引入野生型ｐ16基因后口腔鳞癌细胞生物学的变化 ,构建了ｐ16基因真核表达质粒 ,并于体外转染ｐ16基因产物缺乏的舌鳞癌细胞ＴＳＣＣａ中 ,探索ｐ16基因治疗口腔鳞癌的可行性。1 材料 :ｐｃＤＮＡ3真核表达质粒 ;人舌鳞癌细胞系ＴＳＣＣａ ;ｐ16的ＲＴ ＰＣＲ引物顺序 :正义链 :5′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧ 3′ ;反义链 :5′ ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＧ 3′。2 .方法 :(1)ｐｃＤＮＡ ｐ16真核表达质粒的构建 :常规提取ｐｃＤＮＡ3质粒ＤＮＡ ,ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切 ;提取人正常口腔粘膜总ＲＮＡ ;ＲＴ ＰＣＲ扩增ｐ16全长ｃＤＮＡ ;ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切 ,纯化后和线性ｐｃＤＮＡ3进行连接反应 ,筛选阳性克隆 ,ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切鉴定定向克隆的重组质粒ｐｃＤＮＡ3 ｐ16。(2 )ｐｃＤＮＡ3和ｐｃＤＮＡ3 ｐ16转染ＴＳ...     

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。     

表达人CD40配体的重组腺病毒载体的构建

目的　构建含有hCD40L基因的重组腺病毒载体,为其在动物模型体内表达和肿瘤基因治疗提供基础。方法　用XhoⅠ、SwaⅠ双酶切质粒pORF-hCD40L,回收1 900 bp基因片段并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中 XhoⅠ、EcoRⅤ双酶切位点,得到重组质粒pShuttle-hCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化 BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。酶切分析和PCR鉴定重组的腺病毒。结果　酶切分析、PCR验证表明,hCD40L基因成功克隆到腺病毒pAdEasy-1 载体中。结论　成功构建表达hCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其在哺乳动物内表达及基因治疗提供了基础。     

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰＰ）成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰＰ成熟区的基因片段（约３ｋｂｐ）,将所５得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ     

人釉原蛋白编码区基因原核表达载体的构建

目的：构建人釉原蛋白（amelogenin，AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。方法：运用TA克隆技术。将AMG基因片断插入质粒pMD18-T，通过BamHⅠ和X幻Ⅰ双酶切后。T4 DNA连接酶连接目的基因AMG与原核表达质粒pGEX-4T—1，最终获得重组原核表达载体pGEX-4T—1/AMG。结果：对重组质粒pMD 18-T／AMG和pGEX-4T-1，AMG进行酶切和测序鉴定，酶切电泳图和测序结果与预期结果一致。结论：成功构建了人釉原蛋白（AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。     

骨形成蛋白2基因注射小鼠骨骼肌表达的初步实验研究

目的：探讨骨形成蛋白（ＢＭＰ）基因能否直接导入骨骼肌细胞并表达。方法：将ＭＢＰ２真核表达质粒注射于小鼠骨骼肌内,１４ｄ后分别用ＨＥ及免疫组化ＡＢＣ法观察组织学变化和ＢＭＰ２的表达情况。结果：注射部位局部有炎症反应,部分骨骼肌细胞内可见ＢＭＰ２的阳性信号。结论：直接注射ＢＭＰ２基因可使其导入骨骼肌细胞内并表达。     

质粒表达载体pIRES-CD的构建及其在ACC-2细胞中的表达

目的:克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.构建质粒表达载体pIRES-CD,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立稳定表达大肠杆菌CD基因的ACC-2细胞克隆.方法:通过PCR从大肠杆菌DH5α DNA中扩增出CD基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中,进行序列测定.测序正确后,将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD基因的质粒表达载体pIRES-CD,采用电穿孔法,以质粒表达载体转染ACC-2细胞,用400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD基因的ACC-2细胞系.提取该细胞的总RNA,用RT-PCR检测CD基因的表达.结果:PCR扩增出1280bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的CD序列基本一致:阳性重组质粒pIRES-CD经XbaI和NotI双酶切后,获得6.1kb和1280bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出228bp的预期片段.结论:成功扩增了CD基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-CD;建立了稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,为CD/5-FC自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定了基础.     

携带葡糖基转移酶基因链球菌－大肠杆菌穿梭质粒的构建

作者从ｐＳＰ７３中分离出２２１ｈｐ多克隆区整合至ＰＭＷ１１９。从ｐＳＫ６和ｐＳＫ１６中分离出葡糖基转移酶基因ｇｔｆＢ和ｇｔｆＣ．并整合至这一重组质粒中，分别形成ｐＴＦ４１和ｐＴＦ４２。从ｐＶＡ８３８中分离出链球菌复制子并整合至ｐＴＦ４１和ｐＴＦ４２的适当部位．分别构成重组质粒ｐＺＢ１和ｐＺＢ２。ｐＺＢ１和ｐＺＢ２为分别含ｇｔｆＢ或ｇｔｆＣ基因的链球菌－大肠杆菌穿梭质粒。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PELP1的构建及其在人牙周膜干细胞中的表达

目的 克隆人源脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutanic acid-,leucine-rich proteinl,PELP1)基因全长,构建PELP1基因全长过表达载体,研究PELP1基因表达特点,为PELP1基因在不同组织细胞中的功能性研究奠定基础.方法 采用反转录PCR法从MCF-7细胞总RNA中克隆PELP1基因全长,与含有EcoR I与Xho I双酶切位点的真核过表达载体pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1.经双酶切及测序鉴定重组质粒中PELP1基因的完整性及正确性.运用脂质体将重组质粒转染至人牙周膜干细胞中,运用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别从基因和蛋白水平对转染细胞中PELP1的表达进行检测.结果 成功克隆出PELP1基因全长,并将其插入至pIRES2-EGFP过表达载体中,经双酶切鉴定和测序鉴定证实目的质粒片段插入无误.重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1转染48 h后PELP1基因水平是转染空质粒人牙周膜干细胞的(148.0±1.3)倍,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).蛋白质印迹法结果显示,与转入pIRES2-EGFP的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.3300±0.0117)相比,转入pIRES2-EGFP-PELP1重组质粒的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.6200 ±0.0045)显著增高,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).结论 本项研究成功运用qRT-PCR反应从MCF-7细胞中克隆出PELP1全长基因,并成功构建pIRES2-EGFP-PELP1真核过表达载体.     

口腔粘膜鳞状细胞癌及癌旁上皮中p53及C-erbB-2癌基因蛋白的表达

本文通过对ｐ5 3、Ｃ ｅｒｂＢ 2癌基因蛋白在口腔粘膜鳞状细胞癌 (ＯＭＳＣＣ)及癌旁形态学上正常的上皮、异常增生的上皮中表达的研究来探讨ｐ5 3、Ｃ ｅｒｂＢ 2在ＯＭＳＣＣ发生、发展中的意义。1　材料与方法1 1　标本2 9例ＯＭＳＣＣ标本均来自上海第二医科大学附属第九人民医院口腔病理科 1995 1997年的档案标本 ,其中 2 1例标本中存在癌旁正常上皮 ,19例存在癌旁异常增生上皮。男性2 2例 ,女性 7例 ;病理分级鳞癌Ⅰ级 17例、Ⅱ级 12例。1 2　方法经 4%甲醛固定 ,石蜡包埋的标本作 5 μｍ连续切片 ,ＨＥ及免疫组化染色 (ＡＢＣ法 )…     

重组质粒pcDNA3/sIL-1R(Ⅰ)转染牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的　检测以sIL 1R胞外成熟肽编码区基因作为目的基因构建的重组质粒pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )对人牙龈成纤维细胞的转染效率及瞬时表达量 ,为pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )导入动物牙龈组织提供依据。方法　人牙龈成纤维细胞体外原代培养并传代 ,重组质粒用脂质体包裹介导进行体外转染。ELISA法对重组质粒在人牙龈成纤维细胞的表达产物进行含量检测。结果　sIL 1R(Ⅰ )在基因转染 2 4h内开始表达 ,72h最高 ,转染组细胞培养液和细胞冻融液中sIL 1R表达量均显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,1周后表达逐渐减弱 ,2周后仍有少量表达。结论　通过脂质体介导的基因转染方法 ,重组质粒pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )在人牙龈成纤维细胞系中具有表达功能 ,并且其胞外及胞内均具有特异性表达产物     

白念珠菌RAS1基因高表达菌株的构建及鉴定

目的：构建白念珠菌RAS1基因高表达菌株pCaEXP?RAS1?CAI4。方法：将白念珠菌RAS1基因的开放阅读框（ ORF）置于高表达载体pCaEXP的启动子MET3之后，构建高表达质粒载体pCaEXP?RAS1。将整合的重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α，经扩增后采用质粒抽提试剂盒大量制备pCaEXP?RAS1质粒。单酶切线性化质粒，将线性化的pCaEXP?RAS1经醋酸锂法转化入白念珠菌CAI4细胞内，随后在SD?ura?met?cys选择性培养基获得转化子，构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。挑取单克隆菌落，经菌落PCR验证阳性转化子，并采用实时定量PCR检验RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平。结果：酶切及测序鉴定表明高表达质粒载体pCaEXP?RAS1构建成功，实时定量PCR检验转化子RAS1基因在pCaEXP?RAS1?CAI4菌株的表达水平，表明pCaEXP?RAS1?CAI4菌株构建成功。结论：通过高表达质粒载体pCaEXP?RAS1可以成功构建pCaEXP?RAS1?CAI4菌株。     

变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3／pacA和pcDNA3／pacP在哺乳动物细胞中

目的：研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法：利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别转染ＣＯＳ－７细胞,１ｍｇ．ｍｌ＾－１ Ｇ４１８加压筛选获取稳定转染的ＣＯＳ－７细胞之后,采用ＲＴ－ＰＣＲ法、ＬＳＡＢ法、流式细胞术及Ｗｅｓｔｅｍ印迹法,对真核表达质粒中插入基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ的转录及表达产物进行检测。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ及ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性,表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论：构建的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ和ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质,为进一步     

转染人骨形成蛋白2基因对NIH3TE细胞生物学行为的影响

目的 从分子水平探讨骨形成蛋白对细胞分化的调节作用，并为ＢＭＰ２基因疗法的建立提供依据。方法 用脂持体转染法将入ＢＭＰ２噬菌粒表达载体ｐＢＫ－Ｂ２导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞，Ｇ－４１８筛选获得阳性细胞克隆。原位杂交，免疫组化及夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达分泌，并检测转染细胞增殖活力及碱性磷酸酶和骨钙素的含量。     

TK基因重组质粒的构建及在ACC-2细胞中的表达

目的：克隆胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因，构建质粒表达载体pIRES—TK，并利用该载体转染ACC-2细胞，建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞克隆。方法：通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX—TK中扩增出TK基因全长序列，将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中，构建重组表达载体pIRES—TK，用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞，经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株，提取该细胞株的总RNA，用RT—PCR检测TK基因的表达。结果：PCR扩增出1128 bp大小的片段，测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致；阳性重组质粒pIRES—TK经XhoI和Mull双酶切后获得2692 Bb和1128 bp的片段；RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361 bp的预期片段。结论：成功扩增了TK基因的DNA片段；成功构建了质粒表达载体pIRES—TK；建立了稳定表达TK基因的ACC～2细胞株，为TK／GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础。     

重组真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂（rhIL-1ra）基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,为使用细胞因子拮抗剂基因治疗牙周炎奠定实验基础。方法Trizol法提取人乳腺癌组织总RNA,RT-PCR方法扩增目的基因。胶回收、纯化后产物与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序鉴定正确后将重组克隆载体与真核表达质粒pEGFP-N1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,体外连接。重组DNA转化感受态细菌E.coliTOP10,筛选阳性克隆并鉴定。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA由脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选20d,RT-PCR检测基因的表达,ELISA检测蛋白的表达。结果重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra经PCR及双酶切鉴定均证实人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。稳定转染NIH3T3细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功构建了编码人IL-1ra基因的重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的后续研究奠定了实验基础。